背景：食管癌是世界上常见八大恶性肿瘤之一,死亡率居恶性肿瘤第六位。其病理类型主要包括食管鳞癌和食管腺癌。我国是食管癌高发区之一,主要为食管鳞癌,平均每年病死人数约15万人。由于早期诊断困难,且肿瘤易转移和复发,目前食管癌患者的5年生存率仅为15%-25%。因此,寻找敏感且特异的早期诊断标志物,在分子水平上探索食管癌进展和转移的机制,或可为食管癌的诊断和治疗提供新的靶点和策略。microRNAs(miRNAs)是近年来在生物体内发现的,一类长度约22核苷酸、非编码的进化保守的内源性单链小分子RNA,通过与靶基因信使RNA(mRNA)的3’非翻译区(3’-UTR)相应靶序列碱基之间的结合,降解mRNA或阻断其翻译,从而发挥对靶基因的负性调控作用。miRNAs参与人体内多种生物学过程,包括细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭及迁移等。许多研究表明,一些miRNAs在肿瘤的发生发展中表达异常,发挥促癌或抑癌作用。但迄今为止,真正确认功能的miRNA还只是一部分,其发挥作用的机制也有待进一步研究。目前关于食管鳞癌miRNA表达谱的研究鲜有报道,差异性表达的miRNAs在食管鳞癌发生发展的生物学过程中究竟发挥怎样的作用尚未完全清楚。因此,我们通过miRNA芯片技术研究食管鳞癌的miRNA表达谱,筛选出差异性表达的miRNAs,并进一步对其进行功能学研究,在体内外水平探讨这些miRNAs在食管鳞癌的发生发展中发挥的作用。以期为食管鳞癌的早期诊断提供有效的依据,为今后的治疗方向提供新线索。目的：分析食管鳞癌miRNA表达谱,筛选差异表达的miRNAs,并就其在食管鳞癌发生、发展中的作用及其机制进行初步研究。方法：1.收集南京医科大学第一附属医院2011-2013年间胸心外科食管鳞癌手术所得的食管鳞癌组织和配对正常组织,以及消化科内镜黏膜下剥离术(ESD)所得的食管鳞状上皮上皮内瘤变组织和配对正常组织,确认病理情况；从中选取3对食管鳞癌及配对正常组织,采用人miRNA寡核苷酸芯片进行检测分析,筛选差异表达的miRNAs。选取差异表达的miRNAs(本研究中选取的是miR-139-5p),采用Taqman探针实时荧光定量PCR方法在前期收集的组织中进行验证,并观察其与患者性别、年龄、肿瘤大小、分期、淋巴结转移等临床病理因素的关系；同时验证miR-139-5p在食管鳞癌细胞株Eca109及TE-13中的表达情况。2.将合成的miR-139-5p类似物、抑制剂及对照,瞬时转染人食管鳞癌细胞株Eca109及TE-13。运用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测其对细胞增殖的影响；单细胞克隆形成实验检测肿瘤细胞集落生长能力；流式细胞术检测细胞凋亡能力及周期变化；Transwell实验观察细胞迁移及侵袭能力。3.构建miR-139-5p慢病毒表达载体及其阴性对照,包装慢病毒,感染食管鳞癌细胞株。进行裸鼠成瘤实验,观察其对食管鳞癌细胞体内成瘤能力的影响。4.应用生物信息学软件预测1miR-139-5p可能的靶基因。构建包含靶基因3’-UTR区野生型及突变型报告基因载体,与miRNA共转染入细胞株,检测报告基因的活性；Real-time PCR检测预测靶基因rRNA表达水平：Western Blot检测食管鳞癌细胞及组织中靶基因的表达,在细胞水平检测其下游调控基因的蛋白表达；合成靶基因的小干扰RNA,观察其对下游靶基因的影响。结果:1. Agilent miRNA芯片检测结果显示,与正常配对组织相比,312个miRNAs在食管鳞癌组织中存在差异性表达。以差异倍数(Fold Change)≥2作为筛选标准,有68条miRNAs表达差异显著,其中上调的51条,下调的17条；在这些差异表达的miRNAs中,miR-139-5p、miR-195、miR-130b、miR-183等首次报道于食管鳞癌中。选取miR-139-5p进行实时定量PCR验证,显示与正常食管上皮组织相比,在食管鳞癌组织及食管上皮上皮内瘤变组织中,其表达均下调(p<0.05),但与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分期及淋巴结转移情况没有关联；与人正常食管上皮细胞株Het-1A相比,1mniR-139-5p在食管鳞癌细胞株Eca109及TE-13中均下调(p<0.05)。2.细胞功能实验中,CCK-8实验显示,转染miR-139-5p mimics组细胞在转染后48小时、72小时及96小时的吸光值明显低于阴性对照组NC(p<0.05)；而转染miR-139-5p inhibitor组细胞在三个时间点的吸光值高于阴性对照组INC (p<0.05)。单细胞克隆形成实验显示,过表达rniR-139-5p后,细胞集落数低于对照组(p<0.05)；而下调miR-139-5p后,细胞集落数高于对照组(p<0.05,)。流式细胞术检测细胞凋亡和周期,结果显示,转染miR-139-5p mimics组细胞早期凋亡率增加,细胞发生G1期阻滞(p<0.05);抑制组无明显变化。Transwell迁移及侵袭实验结果发现,过表达miR-139-5p后,食管癌细胞迁移和侵袭能力均下降(p<0.05)；抑制组无明显变化。3.体内裸鼠成瘤实验显示,与对照组相比,通过慢病毒载体上调miR-139-5p的表达可抑制肿瘤的生长(p<0.05)。4.生物信息学软件预测c-Jun和c-Fos均是miR-139-5p作用的靶基因,双荧光素酶报告基因实验显示,与对照组相比,miR-139-5p可降低荧光素酶活性(p<0.05)。Real-time PCR结果显示,转染miR-139-5p mimics及inhibitor后,靶基因1mRNA表达无明显变化；而Western blot检测发现,与正常食管上皮相比,c-Jun和c-Fos在食管鳞癌组织中表达均明显上调(p<0.05);miR-139-5p抑制c-Jun和c-Fos及其下游靶基因Cyclin A、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9的蛋白表达(p<0.05)；转染c-Jun和c-Fos的小干扰RNA, Cyclin A、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9的蛋白表达均受到抑制(p<0.05)。结论：食管鳞癌miRNA表达谱示,食管鳞癌组织中有68条miRNAs表达差异显著,上调的51条,下调的17条；miR-139-5p在食管鳞癌、食管上皮内瘤变组织及食管鳞癌细胞株中表达均下调。过表达miR-139-5p能够抑制食管鳞癌细胞的增殖,致细胞周期阻滞,抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭,抑制裸鼠成瘤。c-Jun和c-Fos是miR-139-5p的靶基因,miR-139-5p通过抑制c-Jun和c-Fos及其下游蛋白Cyclin A、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9的表达抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。