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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是以慢性对称性多关节炎为主要表现的一种系统性自身免疫性疾病,其病因尚不明确。目前临床上有多种药物用于治疗RA,其中甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)已被国际上公认作为改善病情抗风湿的一线治疗药物。但是有部分患者在服用 MTX后疗效不佳,可能与药物转运体介导的MTX吸收机制有关。有机阴离子转运蛋白1(Organic anion transporter1, OAT1)和有机阴离子转运蛋白3(Organic anion transporter3, OAT3)均属于溶质转运体(Solute carrier,SLC)超家族中重要成员。OAT1和OAT3均是摄取性转运体,一个标准的OAT通常包含大约550个氨基酸,形成的12个α螺旋跨膜结构域。OAT在生物体内广泛分布,肝脏、肾脏、脉络丛、大脑、视网膜、睾丸、胎盘和关节滑膜组织等均存在OAT的表达,其中,OAT1和OAT3已经被广泛研究。芍药苷-6-氧-苯磺酸酯(Paeoniflorin-6′-O-benzene sulfonate,CP-25)是由芍药苷(Paeoniflorin, Pae)修饰获得的一种新型活性单体化合物。前期研究发现 CP-25可以逆转 MTX在佐剂型关节炎(Adjuvant arthritis,AA)中的耐药反应,且CP-25和MTX联合用药对其导致的炎症反应治疗作用比单用MTX明显。因此,进一步探究CP-25和MTX联合用药的药效增加分子机制具有重要意义。本实验以滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)为研究对象,从药物摄取角度研究 CP-25对胶原性关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠OAT1和OAT3的调节作用,并从药物相互作用角度揭示两者联用增效的分子机制,以便指导临床合理用药。
目的:
研究CP-25对CIA大鼠FLS中OAT1和OAT3的调节作用,增加MTX的摄取。
方法:
1)建立CIA大鼠模型,根据随机分配原则,分为正常组、CIA模型组、CP-25给药组、MTX给药组和CP-25+MTX联合用药组。通过免疫组化方法和Western blot方法进行各组滑膜组织中OAT1和OAT3的检测。
2)通过PGE2刺激大鼠滑膜细胞,Western blot法检测不同浓度CP-25干预后对PGE2刺激的大鼠滑膜细胞中OAT1和OAT3表达的影响;通过siRNA干扰大鼠滑膜细胞中OAT1和OAT3的表达,筛选最优干扰序列。
3)建立MTX在大鼠滑膜细胞上吸收的UPLC-MS/MS分析方法,通过PGE2刺激、siRNA干扰OAT1,OAT3和叶酸(HCP1)转运体的功能,测定大鼠滑膜细胞内吸收MTX、对氨基马尿酸(PAH)和硫酸雌酮(DHEA)的含量以及CP-25的调节作用。
4)通过siRNA干扰大鼠滑膜细胞OAT1,OAT3和HCP1的功能,使用激光共聚焦法测定MTX在滑膜细胞水平上的吸收强弱以及CP-25的调节作用。
结果:
1)CIA大鼠产生炎症反应,升高足爪容积、全身评分、关节炎指数和足爪肿胀数等指标,造成大鼠脾脏和关节的病理变化。CP-25可以降低整体指标,缓解脾脏和关节的病理改变,且发现CP-25+MTX联合用药组比单用MTX组治疗效果明显。根据免疫组化法和Western blot法可知在大鼠的滑膜组织中有OAT1和OAT3的表达,且CIA模型组中OAT1和OAT3的表达相较于正常组均明显降低;CP-25单独给药组、MTX单独给药组和CP-25+MTX联合用药组中OAT1和OAT3的表达相较于模型组均发生上调。
2)在给与不同浓度PGE2刺激48h后,大鼠滑膜细胞中OAT1和OAT3的表达均下调,其中以0.35μM和1.75μM的浓度刺激有显著性差异,我们选取0.35μM进行下一步实验。通过不同浓度的CP-25干预PGE2刺激的大鼠滑膜细胞24h后,发现CP-25可以升高PGE2刺激的大鼠滑膜细胞中OAT1和OAT3的表达。在给与不同序列siRNA干扰OAT1和OAT348h后,siRNA-OAT1-1437和siRNA-OAT3-1161干扰大鼠滑膜细胞中OAT1和OAT3的表达明显下调,取该序列进行下一步实验。
3)UPLC-MS/MS中,MTX(R2=0.9997)、PAH(R2=0.9993)和DHEA(R2=0.9991),精密度、准确度、回收率、基质效应的RSD和RE值均小于15%。取大鼠滑膜细胞,给与PGE2刺激或siRNA干扰OAT1、OAT3和HCP1转运体48h后,使用含10-5mol/L的CP-25培育24h,样本处理,采用UPLC-MS/MS测定MTX、PAH和DHEA的含量。发现正常组和阴性对照组吸收水平相当,PGE2刺激和siRNA-OAT1、siRNA-OAT3和siRNA-HCP1干扰组中MTX吸收含量均减少,且siRNA-HCP1干扰后下降最多,其次分别是siRNA-OAT3和siRNA-OAT1。PGE2和siRNA-OAT1组中PAH的吸收减少,PGE2和siRNA-OAT3组中DHEA的吸收减少,CP-25干预组中MTX、PAH和DHEA吸收水平均有所上升。
4)使用激光共聚焦法测定MTX的水平,发现正常组和阴性对照组吸收水平相当, siRNA-OAT1、siRNA-OAT3和siRNA-HCP1干扰组中MTX的吸收水平均降低, CP-25干预组中吸收水平均有所上升。
结论:
1)CIA大鼠滑膜组织中OAT1和OAT3的表达均发生下降,CP-25可以上调OAT1和OAT3的表达;
2)PGE2诱导大鼠滑膜细胞中OAT1和OAT3表达下降,CP-25可以上调OAT1和OAT3的表达;
3)PGE2诱导或siRNA干扰的大鼠滑膜细胞中OAT1、OAT3和HCP1的转运体功能均发生下降,CP-25可以改善滑膜细胞中OAT1、OAT3和HCP1的MTX摄取功能,且转运MTX功能强弱为:HCP1>OAT3>OAT1。
目的:
研究CP-25对CIA大鼠FLS中OAT1和OAT3的调节作用,增加MTX的摄取。
方法:
1)建立CIA大鼠模型,根据随机分配原则,分为正常组、CIA模型组、CP-25给药组、MTX给药组和CP-25+MTX联合用药组。通过免疫组化方法和Western blot方法进行各组滑膜组织中OAT1和OAT3的检测。
2)通过PGE2刺激大鼠滑膜细胞,Western blot法检测不同浓度CP-25干预后对PGE2刺激的大鼠滑膜细胞中OAT1和OAT3表达的影响;通过siRNA干扰大鼠滑膜细胞中OAT1和OAT3的表达,筛选最优干扰序列。
3)建立MTX在大鼠滑膜细胞上吸收的UPLC-MS/MS分析方法,通过PGE2刺激、siRNA干扰OAT1,OAT3和叶酸(HCP1)转运体的功能,测定大鼠滑膜细胞内吸收MTX、对氨基马尿酸(PAH)和硫酸雌酮(DHEA)的含量以及CP-25的调节作用。
4)通过siRNA干扰大鼠滑膜细胞OAT1,OAT3和HCP1的功能,使用激光共聚焦法测定MTX在滑膜细胞水平上的吸收强弱以及CP-25的调节作用。
结果:
1)CIA大鼠产生炎症反应,升高足爪容积、全身评分、关节炎指数和足爪肿胀数等指标,造成大鼠脾脏和关节的病理变化。CP-25可以降低整体指标,缓解脾脏和关节的病理改变,且发现CP-25+MTX联合用药组比单用MTX组治疗效果明显。根据免疫组化法和Western blot法可知在大鼠的滑膜组织中有OAT1和OAT3的表达,且CIA模型组中OAT1和OAT3的表达相较于正常组均明显降低;CP-25单独给药组、MTX单独给药组和CP-25+MTX联合用药组中OAT1和OAT3的表达相较于模型组均发生上调。
2)在给与不同浓度PGE2刺激48h后,大鼠滑膜细胞中OAT1和OAT3的表达均下调,其中以0.35μM和1.75μM的浓度刺激有显著性差异,我们选取0.35μM进行下一步实验。通过不同浓度的CP-25干预PGE2刺激的大鼠滑膜细胞24h后,发现CP-25可以升高PGE2刺激的大鼠滑膜细胞中OAT1和OAT3的表达。在给与不同序列siRNA干扰OAT1和OAT348h后,siRNA-OAT1-1437和siRNA-OAT3-1161干扰大鼠滑膜细胞中OAT1和OAT3的表达明显下调,取该序列进行下一步实验。
3)UPLC-MS/MS中,MTX(R2=0.9997)、PAH(R2=0.9993)和DHEA(R2=0.9991),精密度、准确度、回收率、基质效应的RSD和RE值均小于15%。取大鼠滑膜细胞,给与PGE2刺激或siRNA干扰OAT1、OAT3和HCP1转运体48h后,使用含10-5mol/L的CP-25培育24h,样本处理,采用UPLC-MS/MS测定MTX、PAH和DHEA的含量。发现正常组和阴性对照组吸收水平相当,PGE2刺激和siRNA-OAT1、siRNA-OAT3和siRNA-HCP1干扰组中MTX吸收含量均减少,且siRNA-HCP1干扰后下降最多,其次分别是siRNA-OAT3和siRNA-OAT1。PGE2和siRNA-OAT1组中PAH的吸收减少,PGE2和siRNA-OAT3组中DHEA的吸收减少,CP-25干预组中MTX、PAH和DHEA吸收水平均有所上升。
4)使用激光共聚焦法测定MTX的水平,发现正常组和阴性对照组吸收水平相当, siRNA-OAT1、siRNA-OAT3和siRNA-HCP1干扰组中MTX的吸收水平均降低, CP-25干预组中吸收水平均有所上升。
结论:
1)CIA大鼠滑膜组织中OAT1和OAT3的表达均发生下降,CP-25可以上调OAT1和OAT3的表达;
2)PGE2诱导大鼠滑膜细胞中OAT1和OAT3表达下降,CP-25可以上调OAT1和OAT3的表达;
3)PGE2诱导或siRNA干扰的大鼠滑膜细胞中OAT1、OAT3和HCP1的转运体功能均发生下降,CP-25可以改善滑膜细胞中OAT1、OAT3和HCP1的MTX摄取功能,且转运MTX功能强弱为:HCP1>OAT3>OAT1。