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第一部分MCPIP1在三阴性乳腺癌中的表达及临床意义目的:探究单核细胞趋化蛋白诱导蛋白-1（monocyte chemotactic protein induced protein 1,MCPIP1）在三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）及癌旁组织、TNBC细胞及永生化乳腺上皮细胞中的表达差异,进一步分析MCPIP1的表达与TNBC患者预后及临床病理特征的关系。方法:运用生物信息学方法分析TCGA数据库中TNBC组织及其相应癌旁组织中MCPIP1的表达差异;应用免疫组织化学染色法检测TNBC组织芯片中MCPIP1的表达差异;采用Kaplan-Meier生存曲线分析MCPIP1表达水平与TNBC患者生存的关系;采用卡方检验分析MCPIP1的表达量与TNBC患者临床病理特征的相关性;采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）和免疫印迹（western blot）法分析TNBC细胞株及人永生化乳腺上皮细胞株中MCPIP1的表达水平。结果:MCPIP1在TNBC组织中的表达量与癌旁组织相比显著降低;并且MCPIP1在TNBC细胞中的表达量也显著低于正常乳腺上皮细胞。MCPIP1高表达的TNBC患者总生存期明显延长（HR:3.281;95%CI:1.341–8.028;P=0.043）;但在TNBC组织中MCPIP1的表达量与患者的年龄、组织分级、肿瘤大小、淋巴结转移及TNM分期没有显著相关性。结论:MCPIP1在TNBC组织及细胞中的表达显著下调,并且MCPIP1高表达的TNBC患者预后更佳。因此,MCPIP1有望成为TNBC患者可靠的预后预测指标。第二部分MCPIP1对三阴性乳腺癌细胞周期和增殖的影响目的:探究MCPIP1对TNBC细胞周期、增殖的影响。方法:在TNBC细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-157中分别过表达或沉默MCPIP1后,采用CCK8（Cell Counting Kit-8）检测细胞活力;克隆形成、Ed U（5-Ethynyl-20-deoxyuridine）增殖实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期变化;建立荷瘤裸鼠模型,检测MCPIP1在体内对TNBC细胞增殖的影响。结果:CCK8、克隆形成和Ed U增殖实验结果显示:过表达MCPIP1能够明显抑制MDA-MB-231和MDA-MB-157细胞活力和增殖能力;而沉默MCPIP1能够提高MDA-MB-231和MDA-MB-157细胞活力,促进其增殖。流式细胞术结果显示:过表达MCPIP1诱导细胞周期阻滞于G0/G1期,而沉默MCPIP1促进细胞周期由G1期向S期转变。裸鼠成瘤实验结果显示:MCPIP1能够抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。结论:MCPIP1能够通过诱导细胞周期阻滞而抑制TNBC细胞增殖,在TNBC细胞中发挥抑癌基因的作用。第三部分MCPIP1对三阴性乳腺癌细胞可变剪接事件的影响以及调控NFIC可变剪接的分子机制目的:探究MCPIP1对TNBC细胞可变剪接事件的影响以及MCPIP1调控NFIC可变剪接的分子机制。方法:在MDA-MB-231细胞中过表达MCPIP1后,采用转录组测序（RNAseq）技术检测MCPIP1对MDA-MB-231细胞可变剪接事件的影响;进一步采用功能富集分析预测MCPIP1过表达后可变剪接水平发生显著变化的基因对TNBC细胞功能的影响。在MDA-MB-231和MDA-MB-157细胞中过表达MCPIP1,q RT-PCR检测NFIC 9号和10号外显子跳跃的比率。在MDA-MB-231和MDAMB-157细胞中过表达和沉默MCPIP1后,q RT-PCR检测CTF5的表达水平;进一步采用q RT-PCR检测裸鼠移植瘤组织中CTF5表达水平。收集MDA-MB-231细胞采用改良的RNA免疫共沉淀测序（i RIP-seq）技术筛选与MCPIP1结合的RNA;采用HOMER对MCPIP1所有的结合峰序列进行motif富集性分析,筛选出MCPIP1结合的序列中最具代表性的motif;采用minigene实验进一步验证MCPIP1调控NFIC 9号和10号外显子跳跃。结果:RNA-seq结果显示:共有762例与MCPIP1表达相关的可变剪接事件,包括15例3p MXE,22例5p MXE,127例A3SS,16例A3SS&ES,154例A5SS,17例A5SS&ES,129例ES,152例IR,26例MXE,104例cassette exon。功能富集分析结果显示:MCPIP1过表达后可变剪接水平发生显著变化的基因主要富集在有丝分裂的细胞周期、DNA复制、Erb B信号通路和Notch信号通路上。对RNA-seq的数据进一步分析显示:MCPIP1过表达组中NFIC 9号和10号外显子跳跃的比例显著增加。q RT-PCR结果显示:过表达MCPIP1促进NFIC 9号和10号外显子跳跃,上调CTF5的表达;而沉默MCPIP1能够抑制CTF5的表达。i RIP-seq结果显示:MCPIP1的结合峰主要分布在参考基因组的编码区、3’UTR区、5’UTR区和内含子区。进一步对2个重复的i RIP样本进行q RT-PCR,结果显示:NFIC在IP组的表达量显著高于input组。通过HOMER软件对两个重复IP样本中所有peak序列进行motif富集性分析后,筛选出的最具代表性的motif为CGGCCG。Minigene实验结果显示:过表达MCPIP1能够促进野生型NFIC minigene可变剪接,而对NFIC突变型minigene无明显影响。结论:MCPIP1能够调控TNBC细胞中基因的可变剪接,并且MCPIP1过表达后可变剪接水平发生显著变化的基因主要与TNBC细胞周期进程和增殖相关。MCPIP1能够与NFIC pre-m RNA结合促进NFIC 9号和10号外显子跳跃,上调CTF5的表达。第四部分MCPIP1抑制三阴性乳腺癌细胞增殖的分子机制目的:探究CTF5在TNBC细胞中的功能以及MCPIP1是否通过上调CTF5抑制cyclin D1-Rb-E2F1轴从而抑制TNBC细胞增殖。方法:采用生物信息学方法分析TCGA数据库中TNBC组织标本中MCPIP1与CTF5表达的相关性以及CTF5在癌和癌旁组织中表达的差异。在MDA-MB-231和MDA-MB-157中过表达CTF5,采用CCK8检测细胞活力;克隆形成、Ed U增殖实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期变化;western blot检测cyclin D1、p-Rb、t-Rb、E2F1的表达水平。在MDA-MB-231和MDA-MB-157中同时沉默MCPIP1和过表达CTF5,采用克隆形成和Ed U增殖实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期;western blot检测cyclin D1、p-Rb、t-Rb、E2F1的表达水平。在MDA-MB-231和MDA-MB-157中同时过表达CTF5和cyclin D1,采用克隆形成和Ed U增殖实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期变化;western blot检测CTF5、cyclin D1、p-Rb、t-Rb、E2F1的表达情况。在MDA-MB-231和MDA-MB-157中过表达和沉默MCPIP1,western blot检测cyclin D1、p-Rb、t-Rb、E2F1的表达情况。采用免疫组化检测裸鼠移植瘤组织中MCPIP1、cyclin D1、ki67的表达水平。在MDA-MB-231和MDA-MB-157中过表达带flag-tag的CTF5过表达质粒,免疫荧光检测CTF5的亚细胞定位。运用Integrative Genomics Viewer（IGV）预测CTF5在cyclin D1启动子区的结合位点。在MDA-MB-231和MDA-MB-157细胞中过表达CTF5,采用染色体免疫共沉淀实验检测CTF5是否与cyclin D1启动子区结合。采用荧光素酶报告基因实验检测CTF5是否抑制cyclin D1的转录。结果:生物信息学分析结果表明:在TNBC中,MCPIP1与CTF5的表达成正相关;CTF5在TNBC中的表达较癌旁组织相比有降低的趋势,但无明显统计学差异。过表达CTF5能够明显抑制MDA-MB-231和MDA-MB-157细胞活力和增殖,抑制细胞周期由G1期向S期转变。回复实验结果显示:过表达CTF5可逆转MCPIP1下调对TNBC细胞增殖和周期的促进作用。过表达CTF5能够抑制cyclin D1、p-Rb和E2F1的表达,但对t-Rb的表达无明显影响。而过表达cyclin D1可逆转CTF5对TNBC细胞增殖和周期的抑制作用以及对p-Rb和E2F1蛋白表达的抑制。过表达MCPIP1能够抑制cyclin D1、p-Rb和E2F1的表达,而沉默MCPIP1能够上调cyclin D1、p-Rb和E2F1的表达。免疫组织化学染色显示:MCPIP1能够抑制移植瘤中cyclin D1和Ki67的表达。回复实验结果显示:过表达CTF5能够逆转MCPIP1下调对cyclin D1、p-Rb和E2F1蛋白表达的上调作用。免疫荧光结果显示:CTF5主要定位于细胞核。IGV预测结果表明:cyclin D1启动子区有CTF5的潜在结合位点（chr11:69455832-69456066）。染色体免疫共沉淀结果显示:CTF5能够直接与cyclin D1启动子区结合。荧光素酶报告基因结果显示:CTF5能够抑制cyclin D1的转录。结论:CTF5在TNBC中发挥抑癌基因的作用。CTF5通过抑制cyclin D1转录而下调cyclin D1-Rb-E2F1信号轴。MCPIP1通过上调CTF5抑制cyclin D1-RbE2F1轴,诱导细胞周期阻滞,最终抑制TNBC细胞增殖。