研究背景与目的邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯(Di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)属于邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs),是目前世界范围内应用最广泛的增塑剂之一。由于DEHP与产品基质间为非共价结合,因此随着使用时间的推移,DEHP容易从产品中释放到周围环境造成污染,继而通过饮水、摄食和呼吸等多种途径进入生物体,最终对环境和生物体健康造成危害。2011年台湾塑化剂事件发生后,DEHP所引起的食品安全问题得到了公众的广泛重视。2012年我国食品安全风险评估专家委员会给出人群接触DEHP的推荐值,认为对于60kg体重的人来讲,每天摄入3.0mg的DEHP是安全的。研究认为,人体摄入DEHP的途径90%来自于饮食,而饮食的摄入实际上是指用于食品的包装材料中DEHP的含量[1-4]。因此,在即将于2017年10月19日实行的关于限制在食品接触材料及用品中添加剂使用的新国标(《食品安全国家标准食品接触材料及制品用添加剂使用标准》GB9685-2016)中,不仅规定DEHP在PVC材料中添加量不得超过5%,而且规定含DEHP的材料和制品不能用于接触性脂肪性食品、乙醇含量高于20%的食品和婴幼儿食品,且迁移量不得超过1.5mg/kg[5]。虽然国标从食品接触材料的方面控制了 DEHP的迁移量,但是目前研究报道的在医疗器材、装修材料以及化妆品等其他材料中的迁移也不容小觑。近年来DEHP被认定为是一种环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors,EEDs),能够对生物体的生殖发育和繁殖能力造成一定影响,关于DEHP毒性影响的研究报告也日趋增加,人们越来越关心DEHP对人体健康不造成影响的安全限量[6]。因此,本实验对实验大鼠进行DEHP的90天经口毒性实验,以风险评估委员会推荐的DEHP的安全限量值(3.0毫克/人/天),设人的体重为60kg,即以0.05mg/kg为最低剂量,考虑到不确定系数100(10×10),即大鼠试验以5mg/kg为最低剂量组,再以5mg/kg的10倍、100和500倍分别设立DEHP实验组,即5、50、500、2500mg/kg剂量组,同时设对照组和DEHP染毒恢复组(2500mg/kg),共6组大鼠,每组20只,雌雄各半。恢复组动物停止给予DEHP后继续观察30天,以观察DEHP毒性的可逆性、持续性和迟发效应。试验期间至少每天观察一次动物的一般毒性表现,并记录大鼠出现中毒的体征、程度和持续时间及死亡情况。每周记录体重、摄食量、计算食物利用率;进行血液学检查、血生化检查等常规指标的检测和全面的病理检查等。为初步确定DEHP的经口安全性、得到DEHP毒性作用的靶器官进行DEHP对大鼠的90天经口毒性试验,以期得到关于DEHP毒性的安全限值,为DEHP进一步的风险评估奠定基础。研究方法:1、DEHP亚慢性染毒对大鼠一般性指标的影响:观察并记录大鼠在饲养期间的一般情况(如日常行为表现、中毒和死亡情况等);于每周称量记录体重、摄食量,并计算总的食物利用率;对肝脏、肾脏、脾脏、睾丸、附睾、全脑进行解剖称重,计算脏/体比值,并进行统计学分析。2、DEHP亚慢性染毒对大鼠生化及血液学指标的影响:取大鼠全血,并分别应用①全自动生化仪检测总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cre)、血清葡萄糖(GLU)、血清钾(K)、钠(Na)、钙(Ca)、磷(P)、血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(CHOL)等14个生化及电解质指标;②全自动血细胞分析仪检测白细胞总数(WBC)、红细胞总数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、直接测定的血红蛋白浓度(CMCH)、红细胞体积分布宽度(RDW)、血红蛋白含量分布宽度(HDW)、血小板总数(PLT)、平均血小板体积(MPV)、中性粒细胞(NEUT)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BASO)、单核细胞(MONO)、淋巴细胞(LYM)和未染色的大细胞数量(LUC)以及其相应的百分比等指标。SPSS统计软件分析结果。3、DEHP亚慢性染毒对大鼠精子运动能力和脑脂质过氧化的影响:①DEHP对大鼠精子运动能力影响的研究:利用大鼠附睾尾精子制备精子悬液,应用计算机辅助精子分析仪(CASA)对精子的运动参数进行测量,包括:VCL、VSL、VAP、ALH、LIN、STR、BCF、ELON等;②DEHP对脑脂质过氧化的影响:将脑组织利用超声匀浆机制备成脑匀浆液,离心取上清液-20℃冷冻保存,分别进行活性氧(ROS)、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)以及蛋白浓度的测定。4、DEHP亚慢性染毒对大鼠组织病理学的影响:处死大鼠,迅速分离取出大鼠的肝脏、肾脏、肾上腺、脾脏、胃肠、睾丸(卵巢)、附睾及全脑,将取下的组织立即置于事先准备好的10%的福尔马林固定液中固定。制作组织病理学石蜡切片,观察组织病理学改变。研究结果:1、DEHP亚慢性染毒对大鼠一般性指标的影响:在染毒期间,对照组、5、50和500mg/kg剂量组均无观察到明显的差异;而2500mg/kg DEHP染毒组动物则均表现出精神亢奋、被毛蓬松、局部脱毛(头颈部、四肢及腹部)等中毒体征,摄食量减少,大鼠体重在染毒后显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);各剂量组动物的总食物利用率之间差异无统计学意义(P>0.05)。计算大鼠的脏/体比值结果得到DEHP染毒剂量为500mg/kg时,与对照组相比大鼠的肝脏、肾脏、附睾体比值有明显的变化,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);染毒剂量增加到2500mg/kg时,大鼠肝脏、肾脏、脾脏、脑、睾丸、附睾的脏/体比值与对照组比较均出现较大差异,且差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),实验期间2500mg/kg剂量组未出现大鼠死亡。2、DEHP亚慢性染毒对大鼠生化及血液学指标的影响:①血液生化指标的影响:与肝脏、肾脏相关的生化指标在DEHP染毒剂量为500mg/kg时开始出现异常;与无机盐代谢相关的生化指标在DEHP染毒剂量为2500mg/kg时均出现异常;与脂类代谢相关的生化指标中,CHOL含量在500和2500mg/kg时降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),雌、雄大鼠在各个染毒剂量组均未见TG含量异常。②血液血细胞的影响:对于白细胞相关指标,在染毒剂量为500mg/kg 时,LYM 上升,EOS、HGB 和 MCH 指标下降,在 2500mg/kg 时,白细胞数量减少,并且相关指标发生改变。3、DEHP亚慢性染毒对大鼠精子运动能力和脑脂质过氧化的影响:①大鼠精子运动能力的影响:5mg/kg剂量摄入DEHP即可影响精子运动LIN,DEHP染毒剂量为50mg/kg时,对BCF也有影响,这表明精子的活跃程度也降低;在500mg/kg 剂量组中,与对照组相比较,VAP、VSL、VCL、ALH、BCF、LIIN、STR和ELON均有下降,DEHP染毒最高剂量组和恢复组中所有CASA检测结果显示无活动精子。②脑脂质过氧化的影响:随着染毒剂量的上升,ROS水平先上升后下降,MDA水平随着染毒剂量的增加不断上升。4、DEHP亚慢性染毒对大鼠组织病理学的影响:DEHP染毒5mg/kg时,仅观察到个别大鼠器官见少量炎症反应,未见病理性病变;当染毒剂量为50mg/kg大鼠的肝脏、肾脏、睾丸、附睾和卵巢均出现病理改变,并随着剂量的上升病变加重;在经过30天恢复期后,附睾未见明显恢复。结论:通过对大鼠90天经口毒性试验可以得出,雄性大鼠的生殖器官是DEHP毒性作用的靶器官,其中附睾对DEHP毒性作用最为敏感。试验得出5mg/kg的染毒剂量即可以对大鼠精子的运动直线性有影响,并且经过30天的恢复期,附睾的病理及各项检测指标未见任何恢复。试验得出DEHP对雌性和雄性大鼠的毒性作用有所差别,雌性大鼠对DEHP毒性的耐受性明显强于雄性大鼠,且具有一定的迟发效应,对雌雄大鼠的毒性耐受差异还应进一步进行长期试验观察。观察试验指标可以得到DEHP具有明显的剂量-效应关系,多数指标都随着DEHP的剂量上升出现明显的增大或者减小的趋势。同时,DEHP对大鼠的代谢过程产生影响,在大鼠脑脂质过氧化的试验得出DEHP可能是通过其对大鼠脑神经细胞的氧化损伤作用,对大鼠的脑组织产生损害的,具有明显的神经毒性。