研究背景乙型肝炎是人类健康的严重威胁,引起乙肝的病原体是乙型肝炎病毒(HBV)。根据世界卫生组织所进行的调查统计,全球范围内乙肝的发病率快速增长,已经有超过3亿人感染HBV,中国感染HBV的患者数量众多,约有1亿乙肝患者,且乙肝病毒感染造成的肝脏损伤十分严重,加之乙型肝炎引发的继发疾病(肝功能衰竭、肝癌等)死亡率较高,使其成为严重危害人类健康的问题。抗病毒治疗是乙型肝炎治疗的关键,其主要策略是最大限度地有效抑制HBV增殖,防止病毒进一步损伤肝脏细胞,破坏肝脏的生理代谢功能,减少其引发更严重的肝脏疾病,从而使乙型肝炎患者的病情得到控制。目前,临床常用治疗乙肝的抗病毒药物有核苷类似物(拉米夫定、阿得福韦酯、恩替卡韦、替比夫定等),干扰素(主要是α-干扰素)和免疫调节剂(左旋咪唑、糖皮质激素、白细胞介素2、乙肝免疫球蛋白等)。核苷类似物是目前临床上抗病毒最有效的药物,其作用机制是通过抑制病毒的DNA多聚酶和逆转录酶的活性达到抑制病毒复制的效果,但一旦HBV病毒DNA多聚酶发生变异就会导致耐药,且停药后病情容易反弹和复发。而干扰素和免疫调节剂有严重的副作用。因此,有必要针对新靶点开发能有效抑制HBV转录与复制的新型乙肝治疗药物。众所周知,病毒自身由于没有实现新陈代谢所必需的基本成分,病毒自身不能复制。当病毒感染宿主细胞时,会脱去蛋白质外套,其核酸进入宿主细胞内,借助宿主细胞的关键分子,按照病毒基因的指令产生新的病毒。通过干预宿主细胞的关键分子来抑制病毒的复制是寻找新型乙肝治疗性药物的重要方向,宿主细胞关键靶标分子的选择是药物筛选的前提。SIRT1是近年来病理学研究的热点,它作为第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶,通过去乙酰化修饰的方式调节基因表达。SIRT1的生理作用十分广泛,主要参与调控细胞的生理周期、细胞的应激反应以及细胞内的多种代谢反应,对细胞的正常生长及各种生理功能的调节起重要作用。SIRT1作为第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶,也是形成HBV共价闭合环状DNA(ccc DNA)的微型染色体的一个结构组件,并且Patrice André等学者的研究证实了在SIRT1激活剂作用下,SIRT1与法尼酯X受体(FXR)、过氧化物酶体增殖物活化受体(PPARs)协同作用可使得乙肝病毒RNA的合成大幅增多,我国学者黄爱龙等也证实了SIRT1沉默能显著地抑制HBV复制中间体、3.5 kb的mRNA和核心蛋白的表达,且SIRT1抑制剂对HBV复制中间体等有抑制作用。以上研究表明,SIRT1确实参与了乙肝病毒的转录与复制,提示SIRT1有望成为乙型病毒性肝炎治疗的新靶标。然而,以SIRT1为靶标的抗HBV药物还未有相关报道。替拉那韦是一种已经用于临床的抗病毒药物,本实验室的前期研究表明替拉那韦具有SIRT1抑制活性。因而,研究替拉那韦对乙型肝炎病毒的抑制作用很有意义。研究目的本项目将不同浓度的替拉那韦作用于转染了乙肝病毒的细胞,以拉米夫定和sirtinol作为阳性对照,验证替拉那韦在体外对乙型肝炎病毒复制的抑制作用,分别验证替拉那韦在体外对乙型肝炎病毒DNA复制及三种乙肝抗原(乙肝表面抗原、乙肝e抗原和乙肝核心抗原)表达的抑制作用。并进一步检测替拉那韦对乙肝病毒复制相关蛋白表达量的影响,初步探讨替拉那韦抑制乙肝病毒复制的作用机制。研究内容1.替拉那韦的细胞毒性研究(1)验证替拉那韦对肝脏细胞的毒性,CCK-8法检测替拉那韦对L02细胞、Huh-7细胞、HepG2细胞、HepAD38细胞、HepG2.2.15细胞的细胞毒性,计算增殖抑制率和半数抑制浓度,比较替拉那韦对不同肝脏细胞的细胞毒性作用;(2)以L02细胞、Huh-7细胞、HepG2细胞、HepAD38细胞、HepG2.2.15细胞为靶细胞,CCK-8法比较替拉那韦与阳性对照药物:拉米夫定、Sirtinol(SIRT1抑制剂)对这些细胞的增殖抑制率。2.替拉那韦在DNA水平对乙肝病毒复制的抑制作用研究验证替拉那韦对乙型肝炎病毒在体外复制的影响。以HepAD38细胞、HepG2.2.15细胞为靶细胞,应用荧光定量PCR技术检测乙肝病毒DNA在细胞内的复制情况。3.替拉那韦在蛋白水平对乙肝病毒的抑制作用研究验证替拉那韦对乙型肝炎病毒在体外复制的影响。以HepAD38细胞、HepG2.2.15细胞为靶细胞,应用ELISA技术检测乙肝病毒抗原(乙肝表面抗原、乙肝e抗原和乙肝核心抗原)的表达情况。4.替拉那韦抑制乙肝病毒复制的作用机制的初步研究以HepAD38细胞、HepG2.2.15细胞为靶细胞,应用western blot技术检测替拉那韦对乙肝病毒复制的关键分子(sirt1、AP1等)表达的影响。初步探讨替拉那韦抑制乙肝病毒复制的作用机制。研究结果1.通过CCK-8实验检测替拉那韦的细胞毒性,结果表明:替拉那韦对转染了HBV的HepAD38细胞和HepG2.2.15细胞的细胞毒性明显大于未转染HBV的L02细胞、Huh-7细胞和HepG2细胞,其中对L02细胞的细胞毒性最小。替拉那韦对L02细胞、Huh-7细胞、HepG2细胞、HepAD38细胞、HepG2.2.15细胞的细胞毒性作用呈现明显的浓度依赖关系。并且替拉那韦对上述细胞的细胞毒性作用比阳性对照药物(拉米夫定、Sirtinol)对这些细胞的细胞毒性强很多。2.运用荧光定量PCR技术,检测HBV DNA结果表明:不同浓度的替拉那韦分别作用于HepG2.2.15细胞和HepAD38细胞,替拉那韦能显著抑制HBV DNA的表达,并呈现浓度依赖性。浓度为2.5μmol/L的替拉那韦对HBV DNA的表达的抑制效果与浓度为25μmol/L的sirtinol或浓度为20μmol/L的拉米夫定相当。3.运用ELISA技术,检测乙肝病毒三种抗原的表达,结果表明:不同浓度的替拉那韦分别作用于HepG2.2.15细胞和HepAD38细胞,替拉那韦能显著抑制HBV三种抗原的表达,并呈现浓度依赖性。浓度为5μmol/L的替拉那韦对HBV表面抗原的表达的抑制作用与浓度为25μmol/L的sirtinol或浓度为20μmol/L的拉米夫定相当;浓度为10μmol/L的替拉那韦对HBV e抗原的表达的抑制作用接近浓度为25μmol/L的sirtinol或浓度为20μmol/L的拉米夫定;浓度为10μmol/L的替拉那韦对HBV核心抗原的表达的抑制作用与浓度为25μmol/L的sirtinol或浓度为20μmol/L的拉米夫定相当。4.运用western blot技术,检测替拉那韦对HBV复制的关键分子:SIRT1、AP1表达的影响,结果表明:替拉那韦对转染HBV的肝细胞内SIRT1的表达没有影响,而对转录因子AP1的表达有抑制作用。总结实验结果:替拉那韦在体外试验中能有效地抑制乙型肝炎病毒在肝脏细胞中的增殖,对HBV DNA的复制有明显抑制作用,对乙型肝炎病毒表面抗原、e抗原和核心抗原的表达有较强的抑制效果。因此,替拉那韦有望成为抗HBV的药物,应用于乙型肝炎的治疗。