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病毒性心肌炎(VMC)是一种常见的心血管疾病,可导致扩张型心肌病。其中病原体以柯萨奇病毒B3(CVB3)感染最为常见,目前其发病机制尚不十分明确。研究认为病毒的直接损伤、炎性因子对心肌的损伤和病毒感染后引起免疫介导的心肌损伤有关。Th17细胞是一种新发现以分泌IL-17为特征的CD4+T辅助细胞亚群。已有较多研究提示Th17细胞亚群及其效应分子工L-17参与VMC的发病过程。微小RNA(microRNA, miRNA)是一类内源性长度约16-25个核苷酸的单链非编码小RNA。通过互补配对靶信使RNA的3’UTR碱基,进而形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC),抑制蛋白质的翻译或促进信使RNA分解,从而反向调节作用靶基因的表达。近来研究表明,miRNA与免疫系统疾病密切相关。然而miRNA是否参与VMC发病过程?是否对Th17细胞分化起调控作用?通过什么信号通路进行调控?国内外目前尚未报道。为深入了解miRNA是否参与VMC发病阐明其在在VMC中的作用,寻求VMC新的治疗靶点。本课题拟应用BALB/C小鼠腹腔注射CVB3方法建立VMC小鼠模型,进行四方面研究。第一部分病毒性心肌炎小鼠Th17细胞及相关细胞因子动态变化目的：观察病毒性心肌炎小鼠Th17细胞及其相关细胞因子IL-17、IL-6和TGF-β的变化,进而了解Th17细胞及其细胞因子在VMC中的作用及意义。方法：6周龄雄性BALB/c小鼠随机分为VMC组(n=32)及对照组(n=20)。两组动物均分为0、1、2、4周4个时点亚组,VMC组每亚组为8只。对照组每亚组为5只。通过腹腔注射CVB3建立VMC模型(VMC组),腹腔注射等量的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution, PBS)为对照组,各组小鼠在规定时点取材后取血分离血浆,无菌取心脏和脾。应用HE染色方法检测心肌病理组织学改变、用流式细胞术(FCS)检测小鼠脾Th17细胞数、荧光PCR方法检测心肌组织中IL-17、IL-6和TGF-βmRNA的表达,ELISA法检测血浆IL-17、IL-6和TGF-β蛋白的表达。结果：与对照组相应时点亚组比较,VMC组小鼠心肌组织病理积分从第1周开始升高,第2周达峰值,第4周降低,均有显著性差异(P<0.05)。对照组各亚组之间比较无明显差异(P>O.05)。CVB3感染1周时,Thl7细胞即开始升高,4周达峰值,除0周时点外,VMC组均高于对照组相应时点(P<0.01)。对照组各亚组无明显差异(p>0.05)。VMC小鼠心肌组织IL-17mRNA从1周开始升高,4周时达峰值,除0周时点外,VMC组其他时点均高于对照组(P<0.01)。对照组各亚组无明显差异(P>0.05)。VMC组小鼠血浆中IL-17浓度也是在第1周升高,4周时达峰值。除0周时点外,VMC组其他时点IL-17蛋白表达量均高于对照组(P<O.01)。对照组各亚组比较无明显差异(P>0.05)。VMC组小鼠心肌组织中IL-6和TGF-pmRNA及血浆中相应蛋白也是从第1周时升高,2周时达峰值,4周较2周降低。除0周时点外,VMC组其他时点均高于对照组(P<0.05)。结论：Th17细胞及其相关细胞因子IL-17、IL-6和TGF-β在VMC组小鼠均较对照组增高,提示Th17细胞及其相关因子可能参与VMC的发病。第二部分miRNA表达谱的变化及其与IL-17的相关性分析目的：通过观察小鼠VMC发病过程中miRNA表达谱改变及其与IL-17的关系,探讨miRNA在VMC中的变化及意义。方法：用miRNA全基因表达谱芯片筛查miRNA在VMC小鼠心肌组织中的差异表达,10只6周龄雄性BALB/c小鼠分为VMC组(n=6)及对照组(n=4)。1周后取血,分离血浆,无菌取其心脏和脾脏。常规抽提心室心肌组织总RNA,采用含723条探针miRN基因芯片进行miRNA表达谱差异分析,并通过荧光定量PCR印证小鼠心肌组织差异表达的microRNA水平。结果：与对照组比较,VMC小鼠心室心肌组织miRNA表达谱中差异表达的miRNA共有7个,其中有6个miRNA表达上调(miR-21,miR-21star, miR-665, miR-146b, miR-720和miR-711),但只有1个miRNA(miR-451)表达下调。应用荧光PCR定量法印证芯片结果中VMC组小鼠心肌组织明显差异表达的microRNA。与对照组比较,VMC组心室心肌组织miRNA-21表达为对照组(3.12±0.66)倍、miR-146b表达水平为对照组(4.23±0.89)倍,均较对照组明显升高(P<0.05)。miR-451表达水平降低,为对照组的(0.39±0.09)倍(P<0.05),VMC组心室心室心肌组织miRNA-21和miR-146b表达水平与心脏IL-17水平呈正相关(分别r=0.448和0.328)。结论：在VMMC小鼠心肌组织中miRNA-21、miRNA-146b表达水平增高和miR-451低表达,提示它们可能参与了VMC的发病。第三部分：小鼠VMC模型验证筛选出差异表达的miRNA对Thl7细胞分化的影响目的：体内拮抗miRNA后对小鼠VMC的干预作用,从而进一步确定miRNA对Th17细胞分化的影响。方法：构建包含miR-21和miR-146b抑制体、miR-451过表达的慢病毒表达载体。6周龄雄性BABL/c小鼠48只,随机分成6组,miR-21抑制体组(miR-21组)、miR-146b抑制体组(miR-146b组)、miR-451过表达组(miR-451组)、同型对照组(isotype组)、PBS组和VMC组。miR-21组(n=8)、miR-146b组(n=8)、miR-451组((n=8)isotype (n=8)和VMC组(n=8)小鼠均腹腔注射含100TCID50CVB3病毒0.1ml/只,PBS组腹腔注射等量的PBS液,在接种病毒后第7天,miR-21组、miR-146b组和miR-451组分别经尾静脉注射含miR-21和146b抑制体和miR-451过表达慢病毒载体10-9TU/0.1ml,isotype小鼠注射转染空慢病毒载体(同型对照),PBS组(n=8)和VMC组不注射慢病毒,第17天时评估各组小鼠生存率的变化、HE染色了解心肌病理改变、荧光PCR法检测小鼠心肌组织IL-17、IL-6和TGF-pmRNA的表达ELISA检测血浆中IL-17、IL-6和TGF-β的蛋白表达、FCS检测各组小鼠脾Th17细胞数变化。结果：抑制miR-21和146b可降低VMC小鼠心脏重量/体重(HW/BW)比值、减少心肌组织内炎性浸润灶、降低心肌病理积分。抑制miR-21和146b还可减少心肌中IL-17蛋白的表达、使血浆IL-17的水平降低,同时减少心肌组织IL-17mRNA及IL-6、TGF-βmRNA表达,减少影响脾Th17亚群细胞的增殖。但miR-451过表达体未明显影响VMC小鼠Th17变化。结论：miR-21和miR-146b抑制体可减轻心肌炎症,同时减少心肌组织IL-17mRNA及脾Th17亚群细胞的增殖,验证miR-21和miR-146b通过调控Th17变化而参与了VMC的发生发展。第四部分：miRNA对Th17细胞分化STAT3信号通路的影响目的：通过观察转染携带miRNA慢病毒载体的小鼠STAT3信号通路的变化,进一步探讨其对Th17细胞分化影响途径方法：小鼠分组取材同第三部分,荧光PCR法检测小鼠心肌组织STAT3mRNA和RORytmRNA的表达,应用Western Blot技术检测VMC小鼠心肌组织中p-STAT和RORyt蛋白的表达。结果：miR-21和miR-146b组小鼠心室肌组织STAT3和RORγt mRNA表达较VMC组降低(P<0.05)。Western Blot结果显示,miR-21和miR-146b组小鼠心室肌组织p-STAT3和RORγt蛋白表达较对照组降低(P<0.05)。结论：miR-21和miR-146b抑制体减少VMC小鼠p-STAT3和RORγt的表达,miR-21和miR-146b可能通过调控STAT3通路的变化进而调控Th17变化而参与了VMC的发病。本课题研究结果显示：(1)VMC小鼠中Th17细胞比例及其相关细胞因子IL-17、IL-6和TGF-β自1周开始表达上调,其中Thl7细胞比例和IL-17高峰在4周出现,IL-6、TGF-β表达高峰在2周出现,提示Th17细胞及其相关细胞因子可能参与VMC发病过程；(2)miRNA全基因表达谱芯片结果提示miR-21和miR-146b在VMC小鼠中高表达,miR-451表达下调,其中miRNA-21和miR-146b表达水平与IL-17表达呈正相关。(3)miR-21和miR-146b抑制体可减轻心肌炎症,同时减少心肌组织IL-17mRNA及脾Th17亚群细胞的增殖,miR-21和miR-146b通过调控Th17变化而参与了VMC的发生发展。(4)miR-21和miR-146b抑制体通过抑制小鼠VMC发病过程STAT3通路而调控Th17变化。