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目的:既往研究证实,胰腺星状细胞(pancreatic stellate cell,PSC)可分泌多种细胞因子参与胰腺纤维化及细胞凋亡过程。本实验旨在研究PSC是否存在于胰岛中及其对胰岛β细胞的影响。
方法:1.以密度梯度离心法分离培养大鼠胰岛,并运用外向生长技术及胰酶消化法从胰岛中分离PSCs,分别以相差及荧光显微镜观察其形态及自发荧光水平,并以免疫组化法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达。2.运用密度梯度离心法分离大鼠原代PSCs。构建胰岛β细胞株Ins-1/胰岛与PSCs共培养系统,并分别以28mmol/L葡萄糖和(或)10IU/ml胰岛素干预不同组别,以Annexin V-PI标记后行流式细胞术分析,检测Ins-1凋亡水平;以MTT法(3-(4,5-methylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)检测Ins-1增殖水平(以吸光度值(Optical Densities,ODs)评估);DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride,DAPI)核染法观察Ins-1细胞凋亡形态;并以电化学发光免疫分析法(electrochemiluminescent immunoassay,ECUA)检测胰岛培养上清中C肽含量。
结果:1.在荧光显微镜下观察,可见胰岛中存在自发荧光阳性细胞;培养14天后胰岛周边出现星形细胞,α-SMA特异性染色呈阳性。2.Ins-1与PSCs共培养后,其凋亡率较单独培养的Ins-1组明显增加(5.03±0.40%vs3.73±0.35%,P<0.05),OD明显下降(1.29±0.17vs2.85±0.31,P<0.05),胰岛与PSCs共培养后上清中C肽分泌量较单独培养的胰岛组明显减少(0.187±0.017 vs0.228±0.026 ng/ml,P<0.05)。3.单独培养的Ins-1/胰岛中,高糖组与空白组相比,Ins-1凋亡率明显增加(7.93±0.40%vs3.73±0.35%,P<0.05),OD明显下降(2.29±0.13 vs2.85±0.31.P<0.05),胰岛C肽分泌量明显减少(0.182±0.009 vs0.228±0.026 ng/ml,P<0.05);高胰岛素组与空白组相比,Ins-1 OD明显下降(1.68±0.21 vs2.85±0.31,P<0.05),胰岛C肽分泌量明显增加(0.334±0.026 vs0.228±0.026 ng/ml,P<0.05)。4.Ins-1/胰岛和PSCs共培养组与单独培养的Ins-l/胰岛组相比,高糖、高胰岛素、高糖+高胰岛素干预后,Ins-1凋亡率均明显增加(11.73±1.21%vs7.93±0.40%,4.90±0.60%vs3.07±0.31%,10.30±1.00%vs6.53±0.50%,P<0.05),ODs均明显下降(0.62±0.07 vs2.29±0.13,0.29±0.04 vs1.68±0.21,0.14±0.04 vs0.59±0.08,P<0.05),胰岛C肽分泌量均明显减少(0.145±0,008 vs0.182±0.009 ng/ml,0.284±0.024 vs0.334±0.026 ng/ml,0.234±0.017vs0.287±0.009 ng/ml,P<0.05),并可在共培养组中观察到更为典型的Ins-1细胞凋亡形态学变化。
结论:1.PSC存在于胰岛中,分离培养过程中可由静止状态转化为活化状态。2.PSC可促进胰岛β细胞凋亡,抑制其增殖及胰岛素分泌。3.高糖可促进胰岛β细胞凋亡,抑制其增殖及胰岛素分泌。4.高糖环境下;PSC的存在可进一步促进胰岛β细胞凋亡,抑制其增殖及胰岛素分泌,参与胰岛β细胞量的减少及功能障碍进程。