miR-leT-7家族在猪甲状腺中的表达分析及其靶基因预测

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在动物基因组中,存在成百上千的长度约22nt的小分子非编码RNA(miRNA),它们在不同水平上发挥着发育控制、基因调控、RNA切割和基因重组等方面的重要功能。miR-let-7家族是目前研究最多的miRNA,研究表明,miR-let-7家族广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物体内,比如:我们前期对猪甲状腺中miRNA深度测序发现,在猪甲状腺中存在miR-let-7家族的9个成员(miR-let-7a、miR-let-7c、miR-let-7d-3p、miR-let-7d-5p、miR-let-7e、miR-let-7f、miR-let-7g、miR-let-7i和miR-98)。此外,还有大量研究证实miR-let-7家族在动物器官的生长发育中发挥着重要的作用,这些预示着miR-let-7是研究甲状腺生长发育的重要候选miRNAs。  本研究选取105日龄约克夏猪胚胎和出生后60,90,150日龄约克夏猪的甲状腺制作切片进行HE染色,研究甲状腺发育形态学的变化,并采用原位杂交(ISH)技术对miR-let-7家族在甲状腺中的表达部位进行定位。采用荧光定量qRT-PCR(quantitative Real-time PCR)对胚龄60,80,105 d和日龄25、60、90、120、150、180 d约克夏猪和金华猪甲状腺中miR-let-7家族成员miR-let-7c、miR-let-7d-3p、miR-let-7d-5p、miR-let-7e、miR-let-7f、miR-let-7g、miR-let-7i的相对表达量进行分析。利用Target Scan软件预测miR-let-7家族(miR-let-7a、miR-let-7c、miR-let-7d-3p、miR-let-7d-5p、miR-let-7e、miR-let-7f、miR-let-7g、miR-let-7i和miR-98)的靶基因,并采用David软件中的KEGG对这些靶基因进行通路分析。  主要研究结果如下:  1.利用HE染色发现,随着日龄的增加,约克夏猪甲状腺滤泡逐渐增大,上皮细胞逐渐变薄,滤泡腔内胶质增多,酸度增加,说明随着猪的生长发育,甲状腺功能逐渐衰退。  2.利用原位杂交技术发现,miR-let-7家族(miR-let-7a、miR-let-7c、miR-let-7d-5p、miR-let-7e、miR-let-7f、miR-let-7g、miR-let-7i和miR-98)在甲状腺滤泡上皮细胞中表达,并且miR-let-7的表达量在出生后有先减少后增加的态势。  3.通过荧光定量PCR结果发现,在同一猪种生长发育的不同阶段,miR-let-7家族成员的表达量变化趋势存在差异,比如约克夏猪的miR-let-7c、miR-let-7d-3p、miR-let-7d-5p、miR-let-7e、miR-let-7f、miR-let-7i表达量随着胚龄增加逐渐升高,而miR-let-7g的含量则先增后减;同一时期,miR-let-7家族的某些成员之间的表达量也存在显著差异,比如约克夏105日龄胚胎中miR-let-7c在甲状腺中高水平表达(P<0.05),说明miR-let-7c、miR-let-7d、miR-let-7e、miR-let-7f、miR-let-7g、miR-let-7i在猪甲状腺生长发育过程中发挥的功能存在差异,miR-let-7c在胚胎期甲状腺生长中发挥了重要的作用,而miR-let-7g的作用较微弱;miR-let-7家族成员在金华猪和约克夏猪甲状腺中的表达存在种间特异性,比如,在胚胎期,约克夏猪的miR-let-7c、miR-let-7d-5p、miR-let-7e、miR-let-7f、miR-let-7i表达量随着日龄的增加逐渐上升,而金华猪呈现出先增后减的趋势;生长期,金华猪和约克夏猪的miR-let-7的表达量变化趋势也没有统一性,而且在同一日龄,某些miR-let-7家族成员在两猪种上的表达差异显著。  4.通过KEGG软件对miR-let-7家族预测的靶基因进行通路分析,发现miR-let-7家族和各种癌症的产生有着密切的联系,预示甲状腺癌的产生可能和miR-let-7家族有一定的联系。
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