创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）的定义是由于外部机械力造成的脑损伤,并导致大量的死亡和残疾,许多受害者有功能障碍,如运动和感觉功能障碍,甚至认知功能缺陷。据估计,全世界每年约有5000万人被诊断为TBI。颅脑损伤根据发生的不同过程和阶段,可分为原发性和继发性脑损伤,都是由脑外伤引起的复杂疾病。组织丢失和细胞死亡是主要的损伤,TBI后由于原发性颅脑损伤导致的继发性脑损伤,导致激活的小胶质细胞、募集的中性粒细胞和巨噬细胞以及血液代谢物中引起的炎症反应均可导致继发性脑损伤,进而导致进一步的功能性和器质性的脑损伤。炎症反应被认为是TBI继发性损伤的重要机制。从理论上讲,减少炎症改善受损脑组织能量及代谢可以减轻TBI引起的继发性脑损伤。降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide CGRP）是由37个氨基酸组成的多肽,广泛表达于中枢和外周神经系统。目前,CGRP被认为是最有效的血管舒张药。CGRP在脑组织中起保护作用。当脑组织受到损伤并出现缺血时,小鼠脑TBI后产生大量自我保护物质,CGRP是其中最重要的保护物质之一。研究表明,在TBI后的病理过程中,CGRP的分泌在TBI后增多。增加的目的是使脑血管扩张,尽快为损伤后缺血缺氧的脑组织提供血液供应。然而,当脑组织损伤缺血较严重时,脑组织产生的CGRP不能完全防御这种损伤。因此出现了严重的脑组织继发性和永久性损伤。考虑到CGRP具有保护脑损伤的潜力,而自噬和凋亡在TBI诱导的继发性损伤中发挥重要作用,我们检测了CGRP是否能抑制TBI小鼠的自噬和凋亡的表达。结果表明,CGRP通过减轻脑水肿、调节神经元自噬和凋亡,减低TBI后神经炎症反应来保护大脑。第一部分创伤性颅脑损伤患者血清CGRP水平及与预后的关系目的:临床工作中,观察不同TBI患者CGRP表达变化、判断伤情程度,进一步探讨CGRP与TBI患者病情程度及预后的关系,并探讨CGRP是否可以作为判断TBI预后的可靠指标。方法:选取138例TBI患者进行分组:健康体检者54例（对照组）,重度TBI组73例,轻度TBI组65例。采用酶联免疫分析试剂法（ELISA）,测定TBI患者特定时间的血清CGRP水平。采用格拉斯哥昏迷量表（GCS）判定TBI严重程度。统计分析:各组不同时间CGRP比较采用重复测量资料的方差分析,同一时间组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法。采用wilicoxon秩和检验分析患者血清CGRP水平与临床变量的关系。结果:1.TBI后患者血清CGRP的变化对照组随时间变化呈现平稳状态,TBI（轻度组）和TBI（重度组）先下降后逐渐上升。两组血清CGRP水平均低于对照组。入院时、1天、3天、7天和14天时间点,TBI（重度组）低于TBI（轻度组）,差异显著,有统计学意义;入院时、1天、3天时间点,TBI（轻度组）低于对照组,差异显著,有统计学意义;入院时间点7天和14天,TBI（轻度组）低于对照组,但差异不显著。2.入院时TBI患者血清CGRP水平与临床病理特征关系相对于GCS评分<5分的患者,GCS评分≥5分的患者血清CGRP水平较高（Z=-2.277,P=0.023）。存活患者的CGRP水平高于死亡患者（Z=-3.571,P<0.001）。3.入院血清CGRP预测TBI患者伤后死亡的价值评估血清CGRP水平预测TBI患者伤后死亡的特异度为88.24%,灵敏度为68.82%,CGRP预测最佳临界值为13.255pg/ml。4.TBI患者预后与血清CGRP的相关性CGRP高水平组患者生存情况优于低水平组患者,差异显著;单因素Cox分析发现,年龄,中线结构移位,GCS分数,CGRP水平与TBI患者预后相关;多因素Cox分析发现,中线结构移位,CGRP水平是TBI患者独立预后因素。小结:1.TBI后患者血清中的CGRP变化趋势为随伤后时间变化先降低,然后逐渐升高。约至24小时到达最低点,大约在14天前后达高峰。2.血清CGRP水平可以预测TBI患者的预后不良及死亡,而且该预测效能较高。第二部分降钙素基因相关肽（CGRP）对小鼠创伤性颅脑损伤神经功能的保护作用目的:通过重物打击法（Feeney重物下降挫伤法）,建立开放性创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）动物模型,并予以脑室注射联合尾静脉注射外源性降钙素基因相关肽（CGRP）干预TBI模型小鼠;通过旷场实验、水迷宫实验、巴恩斯迷宫实验、跳台实验对实验小鼠的行为学评分进行测量,验证（CGRP）对创伤性颅脑损伤神经功能的保护作用。通过测量CGRP干预前后小鼠脑挫伤面积比较、脑水肿比较、血脑屏障破坏程度等方面的比较,来探讨CGRP对TBI小鼠脑损伤的保护作用。方法:清洁级（SPF）雄性BALB/C小鼠390只,随机分为sham组、TBI组和TBI+CGRP组。用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg,i.p.i.）麻醉小鼠,根据Feeney重物下降法,建立开放性颅脑创伤模型。TBI+CGRP两组分别用CGRP肽（脑室注射+尾静脉注射）,术后每日采用改良神经严重程度评分（m NSS）检测各组小鼠的神经功能缺损程度。各组小鼠分别于术后相应的时间点（1、3、5、7天）取材;苏木精伊红染色（HE染色法）和（TTC）染色法:测量小鼠脑组织损伤面积,并进行组间对比;通过干湿重法测量不同组别小鼠的脑组织含水量;通过测量Evans Blue（EB）渗透率的方法,来判定TBI后血脑屏障的破坏程度。通过蛋白质印迹法（Western blot）测量脑组织CGRP蛋白的表达量。通过行为学测试对小鼠神经行为学进行测量:术后第8、9天进行旷场实验;术后第10-15天行水迷宫实验;术后第16-22天行巴恩斯迷宫实验;术后第23、24天为跳台实验的训练和测试阶段。结果:1.创伤性颅脑损伤（TBI）（Feeney重物下降挫伤法）动物模型稳定:术后小鼠平均昏迷时间约为1.5-2h,生命体征较平稳,体温恢复,呼吸平稳,逐渐苏醒和爬行,可进食水。脑组织经解剖,均可见局部挫伤灶,局部坏死、淤血,伴部分脑组织的凹陷缺损;部分样本损伤灶同侧可见蛛网膜下腔出血。2.各组小鼠m NSS评分差异术后第1天,TBI+CGRP组和TBI组相对sham组,神经功能均受损明显。TBI+CGRP组和TBI组神经功能基本相同,差异无统计学意义;在TBI后第2-7天,TBI+CGRP组小鼠m NSS评分低于TBI组,差异显著;第2-7天TBI+CGRP组和TBI组神经功能逐渐有所好转,两组小鼠的分数逐渐下降。3.TBI小鼠神经功能行为学评分结果旷场实验（Open field test）评分结果:总活动距离测试:sham组总距离最长,TBI+CGRP组小鼠的总距离居中间水平,TBI组的总距离最短。TBI+CGRP组小鼠的总距离相比TBI组的总距离长,差异显著。静止次数和静止时间和测试方面:TBI组小鼠静止次数最多,sham组和TBI+CGRP组静止次数较低,和TBI组小鼠相比,差异不显著,无统计学意义。TBI组小鼠静止时间最长,sham组和TBI+CGRP组静止时间相对较最低,和TBI组小鼠相比,差异不显著,无统计学意义。水迷宫实验:定位航行实验阶段:水迷宫测试小鼠发现平台的潜伏期,TBI+CGRP组小鼠的潜伏期相比TBI组小鼠的潜伏期时间短,差异显著,有统计学意义。TBI组小鼠比sham组小鼠的潜伏期长,差异显著,有统计学意义。空间探索实验阶段:在测试的第五天小鼠穿过平台次数,sham组最多,TBI组最少,TBI+CGRP组居中。TBI组穿过平台次数相比sham组少,差异显著,有统计学意义;TBI+CGRP组穿越平台次数多于TBI组,差异显著,有统计学意义。巴恩斯迷宫测试:训练阶段:TBI组小鼠的潜伏期相比较TBI+CGRP组小鼠的潜伏期长,差异显著,有统计学意义。第六天试验中,第一次探查目标洞（无暗箱）前的错误探查次数比较,TBI+CGRP组小鼠的探错次数相比TBI组小鼠多,差异显著,有统计学意义。跳台实验评分:在跳台试验测试阶段,TBI+CGRP组小鼠的潜伏期相比较TBI组小鼠的潜伏期长,差异显著,有统计学意义;错误次数:TBI+CGRP组小鼠的错误次数相比较于TBI组小鼠的错误次数少,差异显著,有统计学意义。4.不同组别小鼠脑组织标本创伤面积的测量和比较:三组小鼠脑组织切片相比较:TBI+CGRP组与TBI组相比较,均可见一定程度的脑组织损伤及局灶性神经细胞组织缺失,早期缺损范围的差异性较小。随着时间的推移,TBI小鼠脑组织切片可见更严重的脑损伤;定量计算脑损伤体积,TBI+CGRP组小鼠脑组织切片与TBI组小鼠脑组织切片相比较,损伤面积略小,但差异不显著,无统计学意义。5.脑水肿测定:外源性CGRP干预,将TBI术后脑水肿消退的时间点提前,减少了TBI诱导的脑水肿在TBI后持续时间,加速了TBI诱导的脑组织水肿的吸收,进而减轻脑损伤;另一方面,TBI+CGRP组小鼠的脑含水量在1天、3天、5天、7天这四个时间点,脑水肿程度均低于TBI组小鼠,差异显著,有统计学意义。6.血脑屏障损伤程度:TBI术后第1天,sham组未见明显依文思蓝（EB）渗出,TBI+CGRP组小鼠（EB）渗透率和TBI组相比无明显差异;TBI后第3、5、7天,TBI+CGRP组和TBI组小鼠依文思蓝（EB）渗透率仍较高,TBI+CGRP组小鼠依文思蓝（EB）渗透率低于TBI组,两者差异显著,有统计学意义。7.TBI后各组小鼠CGRP蛋白表达水平的差异:TBI组小鼠脑组织中CGRP表达水平显著降低,并随着时间的推移逐渐升高;TBI+CGRP组脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,差异显著,有统计学意义。小结:1.根据Feeney重物下降法,可建立标准、可靠的开放性颅脑损伤动物模型,术后正常喂养及观察行为学变化,确认TBI模型建立。2.CGRP干预减低了创伤性颅脑损伤小鼠的神经功能损伤,减低了创伤性颅脑损伤挫伤灶的损伤面积;减低了创伤性颅脑损伤后脑水肿的程度,减少了TBI后脑水肿的持续时间;减轻了TBI后血脑屏障的破坏程度。3.通过蛋白印迹法可见TBI后小鼠脑组织中CGRP的表达水平显著降低,24h达最低,随时间推移逐渐回升。TBI+CGRP组小鼠脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,提示本实验采用的脑室注射+尾静脉注射干预途径有效可靠。第三部分降钙素基因相关肽（CGRP）对创伤性颅脑损伤后神经元细胞自噬和凋亡的影响目的:通过对小鼠挫伤脑组织部位取材,对其进行自噬和凋亡相关标志性蛋白检测,观察对比CGRP干预前后自噬和凋亡标志性蛋白的变化情况,探讨CGRP在TBI环境下对自噬和凋亡的调控作用。方法:通过免疫荧光双染法:定位分析LC3和Neu N及GFAP蛋白;蛋白质印迹法,定量分析LC3、P62、Beclin-1、cleaved-caspase-3表达量;TUNEL和Neu N双染色法,分析TBI后神经元凋亡的表达变化情况。结果:1.CGRP对TBI小鼠神经元细胞自噬的影响免疫荧光双染法:脑皮层挫伤区LC3（+）蛋白定位于挫伤部位神经元的胞质中,Sham组可见少量阳性表达,随时间推移阳性表达程度无变化。TBI组于伤后1天可见LC3（+）细胞显著增多,随时间推移表达程度逐渐增强,高于Sham组,差异显著;TBI+CGRP组与TBI组比较,LC3（+）细胞数量较少,表达程度明显减弱,TBI后第1天,差异不显著,无统计学意义;而TBI后第3、5、7天,两组差异性逐渐增强,差异显著,有统计学意义。蛋白质印迹法:部分自噬标志物LC3、P62、Beclin-1蛋白表达与双染结果一致。TBI+CGRP组的LC3II/LC3I比值和Beclin-1水平较TBI组明显降低,差异显著,有统计学意义。P62水平的变化则相反,与sham组相比,TBI导致小鼠P62表达降低,TBI+CGRP组的P62较TBI组明显升高,差异显著,有统计学意义。CGRP的干预导致P62蛋白表达逐渐增强并维持在一个相对较高的阶段。2.CGRP对TBI小鼠神经元细胞凋亡的影响:TUNEL和Neu N双染色显示:TBI导致神经元凋亡增加,挫伤灶周围TUNEL（+）细胞明显增加;TBI+CGRP组的TUNEL（+）较TBI组明显降低,差异显著,有统计学意义;蛋白质印迹法:（Western blot法）:TBI导致神经元凋亡,小鼠挫伤灶脑组织凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3表达升高,皮层组织细胞凋亡增加。TBI+CGRP组的cleaved-caspase-3较TBI组明显降低,差异显著,有统计学意义。3.CGRP对TBI小鼠神经元细胞神经胶质纤维酸性蛋白GFAP的影响:与sham组相比,TBI导致小鼠神经元细胞GFAP数量明显增加,Neu N数量明显减低,而CGRP的干预降低了神经元细胞损伤。脑皮层挫伤区GFAP（+）表达:Sham组可见少量阳性细胞表达,表达不明显。TBI组和TBI+CGRP组伤后1、3、5、7天均可见阳性细胞显著增多。TBI组GFAP（+）计数率高于Sham组,差异显著;TBI+CGRP组GFAP（+）计数率低于TBI组第1、3天差异无显著性,第5、7天差异显著,有统计学意义。脑皮层挫伤区Neu N（+）表达:Sham组可见适量Neu N（+）表达。TBI组和TBI+CGRP组伤后1、3、5、7天均可见Neu N（+）细胞显著减少。TBI组Neu N（+）计数率低于Sham组,差异显著,有统计学意义;TBI+CGRP组Neu N（+）计数率高于TBI组差异显著,有统计学意义。小结:1.TBI后小鼠神经细胞自噬和凋亡水平增加,予以外源性CGRP干预,有效抑制了TBI所致小鼠神经元细胞的自噬和凋亡;2.TBI后小鼠神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在显著增加,CGRP干预后,减少了TBI小鼠颅脑损伤部位的胶质纤维酸性蛋白的出现,保护神经细胞功能。第四部分AKT/m TOR信号通路参与了外源性CGRP对神经元细胞自噬和凋亡的调控目的:通过利用CGRP干预TBI小鼠模型,在信号通路层面探讨CGRP对自噬和凋亡相关通路蛋白的调控情况,进一步探讨CGRP对自噬和凋亡的调控机制。方法:通过CGRP干预TBI小鼠模型,采用蛋白质印迹法（Western Blot法）,测定CGRP干预前后挫伤灶局部脑组织的AKT/m TOR、Fox O3a通路相关标志蛋白的变化情况,并对比CGRP干预前后的蛋白表达变化差异。结果:1.CGRP对AKT/m TOR通路的影响TBI术后导致了小鼠脑神经元细胞内p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR水平降低,TBI+CGRP组和TBI组均低于sham组,差异显著,有统计学意义。CGRP使这两者比值均升高。其中,CGRP对p-Akt/Akt激活作用较明显,术后1、3、5、7天四个时间点,TBI+CGRP组的p-Akt/Akt相比TBI组表达升高,差异显著,有统计学意义;CGRP对p-m TOR/m TOR激活作用较弱,术后第1、3天TBI+CGRP组p-m TOR/m TOR相比TBI组,差异显著,有统计学意义;术后第5、7天TBI+CGRP组p-m TOR/m TOR相比TBI组,差异不显著,无统计学意义;同时,Akt/m TOR信号的激活也在TBI后逐渐增强。2.CGRP对Fox O3a表达的影响TBI术后细胞核中Fox O3a蛋白水平显著升高,而细胞浆中Fox O3a蛋白水平显著降低,证实TBI导致了小鼠脑神经元细胞内Fox O3a蛋白分布的变化。CGRP使细胞核内Fox O3a增加逐渐减弱,而胞浆中Fox O3a逐渐升高。细胞核中Fox O3a蛋白表达情况可见,TBI+CGRP组的Fox O3a蛋白表达低于TBI组,差异显著,有统计学意义;而细胞浆中Fox O3a表达情况可见,TBI术后1、3、5、7天四个时间点,TBI+CGRP组的Fox O3a蛋白表达高于TBI组,差异显著,有统计学意义。小结:1.TBI抑制了Akt/m TOR信号通路的激活,对神经元细胞有损伤作用;外源性CGRP干预促进了Akt/m TOR信号通路的激活,导致了神经元细胞自噬和凋亡的降低,起到了脑保护作用。2.TBI促进了Fox O3a蛋白向神经元细胞核内转移,对神经元细胞有损伤作用;外源性CGRP干预可缓解细胞核内的Fox O3a升高趋势,保护神经元细胞。结论:1.临床TBI患者血清样本中CGRP变化趋势为先迅速降低然后逐渐升高,约24小时到达最低点,大约在14天前后达高峰,与动物模型变化趋势相同。2.血清CGRP水平可以预测TBI患者的预后不良及死亡情况,而且该预测的效能较高。CGRP高水平组远期预后、存活率优于CGRP低水平组;存活患者血清CGRP水平高于因TBI死亡的患者。CGRP可以作为TBI预后不良及死亡评估的参考指标。3.根据Feeney重物下降法,可建立标准、可靠的颅脑挫伤动物模型,术后正常喂养及观察行为学变化,确认TBI模型建立。4.CGRP干预,减低了创伤性颅脑损伤鼠的神经功能损伤,减低了创伤性颅脑损伤挫伤灶的损伤面积;减低了创伤性颅脑损伤后脑水肿的程度,减少了TBI后脑水肿的持续时间;减轻了TBI后血脑屏障的破坏程度;通过蛋白印迹法,可见TBI+CGRP组脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,提示脑室注射联合尾静脉注射的外源性干预途径有效可靠。5.TBI后小鼠神经细胞自噬和凋亡水平增加,神经胶质纤维酸性蛋白GFAP增加;CGRP的干预有效抑制了TBI所致小鼠神经元细胞的自噬和凋亡,减少了TBI小鼠颅脑损伤部位GFAP的表达。6.TBI抑制了Akt/m TOR信号通路的激活,导致了神经元细胞自噬和凋亡水平升高,同时促进了Fox O3a蛋白向细胞核内转移,对神经元细胞有损伤作用;相反,外源性CGRP干预可促进Akt/m TOR信号通路的激活,抑制了神经元细胞自噬和凋亡,缓解了细胞核内的Fox O3a升高趋势,起到了脑保护作用。