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H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛流行,不仅给养禽业造成了巨大的经济损失,而且对人类健康构成威胁。我国是在1994年首次从广东省的鸡场中分离到此病毒,此后,该亚型禽流感病毒迅速蔓延,疫苗的广泛使用未能有效控制该病发生,甚至在免疫鸡群中仍然有病毒感染发生,而且部分毒株已获得了感染哺乳动物的能力,有些猪场分离到了H9N2亚型流感病毒,个别毒株能引起人出现典型的流感症状。但由于H9N2亚型AIV是低致病力禽流感病毒,引起的关注就远低于H5N1禽流感,所以利用反向遗传技术对H9N2亚型禽流感病毒的研究也比较少,因此,本研究选择广东地区H9N2亚型禽流感疫苗株CK/GD/228为研究对象,利用反向遗传技术拯救出了和野生病毒生物学特性一致的病毒r CK/GD/228,建立了基于8质粒基础的H9N2亚型AIV反向遗传系统,并将此系统应用于H9N2亚型AIV感染BALB/c小鼠的致病性及H5亚型疫苗候选株构建的研究中。
本研究将14株H9N2亚型禽流感病毒进行BALB/c小鼠小鼠感染试验,从中筛选出的代表毒株Ck/GD/400可在小鼠肺脏内高滴度的复制,并且可以在脑内检测到病毒,引起小鼠发病、体重严重下降和死亡。利用反向遗传技术拯救出与Ck/GD/400病毒生物学特性相同的病毒rCk/GD/400,结合已建立的rCK/GD/228株H9N2亚型AIV反向遗传系统,研究Ck/GD/400对小鼠强致病力的分子基础。16株单基因片段替换重组病毒的小鼠感染试验结果表明,以弱毒Ck/GD/228的PB2基因替换强毒Ck/GD/400株相应基因获得的重组病毒丧失了对小鼠的高致病性,小鼠体重无明显降低,在小鼠肺内的复制能力也显著降低。而以强毒株Ck/GD/400的PB2基因替换弱毒CK/GD/228株相应基因获得的重组病毒在小鼠肺内的复制能力显著增强,且能引起小鼠体重快速下降和死亡。由此可见,PB2基因的差异是影响病毒Ck/GD/400和Ck/GD/228对小鼠感染性不同的主要原因。
Ck/GD/400和CK/GD/228两株病毒的PB2基因共有10个氨基酸差异,为了进一步确定哪一个或哪几个氨基酸导致两株病毒对小鼠致病力的差异,构建了一系列PB2基因嵌合病毒和点突变病毒并感染小鼠,结果表明,弱毒株Ck/GD/228的PB2基因的627位氨基酸由E突变为K后,使病毒在肺脏内的滴度显著增加,且造成小鼠100％致死;反之,将Ck/GD/400的PB2基因627位氨基酸由K替换为E后,病毒在肺脏内的滴度显著降低,丧失对小鼠的致死性且小鼠体重持续增加。由此可见,PB2基因627位氨基酸是影响H9N2禽流感病毒Ck/GD/400和CK/GD/228对小鼠致病力差异的关键位点。
H5N1亚型禽流感的暴发给世界养禽业造成严重危害,安全有效的疫苗是防制高致病性H5N1亚型禽流感的重要手段。现在广东地区所用的H5N1亚型禽流感的疫苗为Re-5株,在HA分支上属于2.3.4分支,根据本实验室对H5N1亚型禽流感病毒的检测,华南地区优势分支逐渐趋于2.3.2分支,而此两分支间交叉免疫效果并不好,且Re-5株的内部基因来自人H1N1流感病毒PR8株,存在公共卫生安全隐患,CK/GD/228株为广东地区H9N2亚型禽流感疫苗株,毒力比较弱,符合生物安全的要求,可用于构建疫苗株。
在建立的H9N2亚型AIV反向遗传系统的基础上,救获全禽源H5亚型重组AIV疫苗候选株178△H5/228,其HA基因来源于处于2.3.2分支的A/chicken/Guangdong/178/2004(H5N1),通过分子修饰缺失和突变了HA基因裂解位点的多个连续碱性氨基酸,使其具备了低致病性禽流感病毒的HA基因特征。
178△H5/228株病毒接种鸡胚后不致死,IVPI和ICPT结果分别为O和0.14。178△H5/228病毒具有高度的鸡胚生长特性,在接种鸡胚后72小时尿囊液血凝价可达到10log2。178△H5/228株病毒在鸡胚中连续传代20代生物学特性仍然保持稳定。
178△H5/228株具有良好的免疫原性,制备的灭活疫苗单次免疫鸭就可以诱导产生高水平且持久的HI抗体,免疫后对高致病性H5N1亚型禽流感病毒DK/GD/PY株的攻击提供完全保护,免疫鸭攻毒后不发病,不排毒。