论文部分内容阅读
第一章乳腺癌患者组织样本中中性鞘糖脂Fuc-ɑ1,2LacCer的表达目的：本课题研究乳腺癌患者癌组织中主要中性鞘糖脂的表达情况，并与成对的癌旁组织表达的中性鞘糖脂作对比，寻找在乳腺癌中异常表达的鞘糖脂。进而探讨其与乳腺癌的相关性和生物学功能。方法：(1)采取有机溶剂超声波提取的方法提取乳腺癌患者癌组织和对应的癌旁组织样本中的总鞘糖脂，通过SephadexA-25柱分离得到中、酸性鞘糖脂。(2)将分离得到的中性鞘糖脂经过甲基化修饰反应后进行质谱（ESI-LIT-MS）分析。对所得甲基化的中性鞘糖脂进行一级质谱（MS1）和多级质谱(MSn)定性分析，确定各主要中性鞘糖脂的种类及具体结构，对比癌组织与对应的癌旁组织寻找异常表达的鞘糖脂。(3)将结构初步确定的异常鞘糖脂与标准品的质谱结果进行对比分析；将甲基化的中性鞘糖脂进行液相-质谱分析（LC-MS）；将癌组织中性鞘糖脂经相关糖基酶（ɑ1,2fucosidase）处理后质谱分析。综合三方面结果确定异常表达的鞘糖脂的结构。(4)将主要中性鞘糖脂和异常表达鞘糖脂在所有的癌组织和对应癌旁组织中的相对含量进行分析比较；对异常表达鞘糖脂进行前离子扫描质谱含量分析，对比分析癌组织和对应癌旁组织前离子扫描结果；将乳腺癌组织样本中表达异常鞘糖脂在一级质谱图上的信噪比（SNR）与癌旁组织、白血病骨髓样本和肝癌组织样本分析比较；将异常表达的鞘糖脂进行ROC分析确定其临床诊断意义；对不同分子分型的乳腺癌异常表达的鞘糖脂含量进行比较分析。综合以上分析结果确定异常表达鞘糖脂与乳腺癌的关联性。结果：(1)经过一级和多级质谱鉴定，确定乳腺癌癌组织和癌旁组织样本中的主要中性鞘糖脂为GlcCer, LacCer, globotrihexosylceramide （Gb3）,globotetraglycosylceramide（Gb4）。癌组织中性鞘糖脂一级质谱图中的峰1184是Fucosyl-Lactoceramide (Fuc-ɑ1,2LacCer)。另外，前人研究的乳腺癌相关标志物Globo-H（Fucosyl-Gb4）也在乳腺癌癌组织样本中检测到。(2)对主要中性鞘糖脂的相对含量比较得出：GlcCer和Gb3在癌旁组织中表达量较高，LacCer, Globo-H和Fuc-ɑ1,2LacCer在癌组织中高表达。(3) SNR分析得出：与白血病和肝癌相比，Fuc-ɑ1,2LacCer特异性地表达在乳腺癌组织中。ROC分析得出：Fuc-ɑ1,2LacCer作为一个临床诊断指标具有一定的灵敏性和特异性。结论：Fuc-ɑ1,2LacCer在乳腺癌组织中显著高表达且具有特异性；Fuc-ɑ1,2LacCer作为诊断指标具有一定的临床意义。第二章乳腺癌细胞系中鞘糖脂Fuc-ɑ1,2LacCer及其功能的研究目的：观察Fuc-ɑ1,2LacCer在多种乳腺癌细胞系中的表达情况，研究Fuc-ɑ1,2LacCer及相关生物合成酶含量的变化对乳腺癌细胞生物学功能的影响，探讨Fuc-ɑ1,2LacCer及相关生物合成酶在乳腺癌发生发展中的生物学意义。方法：(1)对比多种人乳腺癌细胞系、人白血病细胞系、人肝癌细胞系及人外周血单核细胞中该鞘糖脂的表达情况。(2)通过RT-PCR及Realtime PCR检测乳腺癌细胞系中Fuc-ɑ1,2LacCer相关合成酶（岩藻糖基转移酶）表达情况。筛选出岩藻糖基转移酶1（FUT1）高表达和低表达的细胞系作为后续功能实验的工具细胞系。(3)通过Western Blot方法检测乳腺癌组织样本中岩藻糖基转移酶（FUT1）表达情况。(4)采用RNA干扰技术（RNAi），对岩藻糖基转移酶高表达的细胞系进行基因沉默；构建表达FUT1的质粒（pEGFPN1-FUT1）,对岩藻糖基转移酶低表达的细胞系进行基因过表达操作。对转染后的细胞进行鞘糖脂分析，并对细胞的迁移能力进行检测。结果：(1)对多种不同肿瘤细胞系及人正常细胞Fuc-ɑ1,2LacCer相对含量比较分析，得出Fuc-ɑ1,2LacCer在乳腺癌细胞系中表达水平明显高于其他细胞。(2) FUT1在MDA-MB-157和MDA-MB-453中表达量较高，在MDA-MB-231和MCF-7中表达量较低。选取MDA-MB-453和MCF-7分别作为FUT1基因沉默和过表达的工具细胞系。(3)与相应的癌旁组织相比，FUT1在乳腺癌癌组织中表达量较高。(4)过表达FUT1后，MCF-7中Fuc-ɑ1,2LacCer表达量显著上升，迁移能力有所增强。结论：Fuc-ɑ1,2LacCer在乳腺癌细胞系中高表达并具有特异性。相应的，FUT1在乳腺癌细胞系及病人乳腺癌组织中表达量较高。乳腺癌细胞系中FUT1表达量的上调可以促进乳腺癌细胞的迁移。