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[目的]α-Gal抗原是动物组织、器官引起超急性免疫排斥反应的主要靶抗原,动物源性生物材料经脱抗原工艺处理后仍然残留α-Gal抗原。本研究旨在建立动物源性生物材料α-Gal抗原特异性的免疫原性检测与评价技术。[方法]1、动物源性生物材料Gal抗原含量检测标准化方法的建立与应用采用人工合成的Gal-BSA结合Gal抗原阴性生物材料裂解上清液作为标准曲线样品,以Gal抗原阳性生物材料(猪肝脏来源)与Gal抗原阴性生物材料(人胎盘组织来源)监测实验体系的敏感性和特异性,利用Gal抗原特异性抗体(M86),建立酶联免疫抑制方法。采用建立的标准方法定量检测脱细胞基质类生物材料(如牛源生物骨修复材料、牛心包来源组织修复补片、脱细胞猪结膜)的Gal抗原残留量;同时考察以猪肝脏为原料制备的Gal抗原阳性生物材料参考品的均一性及稳定性;以协作标定的方式对Gal抗原阳性生物材料参考品的Gal抗原含量进行赋值。2、GGTA1基因敲除小鼠的制备、免疫学特性及应用研究利用细菌染色体同源重组技术制备GGTA1基因敲除(KO)小鼠。采用southern bolt鉴定小鼠基因型的变化。取GGTA1 KO小鼠的主要脏器组织,提取mRNA,采用RT-PCR法鉴定GGTA1 KO小鼠表型的变化。采用Gal抗原含量检测标准化方法检测GGTA1 KO小鼠的主要脏器组织的Gal抗原含量。采用兔血红细胞(外来抗原)免疫刺激GGTA1 KO小鼠,考察小鼠体内总抗体以及抗Gal抗体表达水平的变化。采用GGTA1 KO小鼠皮下植入的方式,从总抗体表达水平,抗Gal抗体表达水平,细胞因子表达水平,淋巴细胞活化水平或亚型分析与局部材料组织病理综合评价动物源生物材料(如:牛源生物骨修复材料、牛心包来源组织修复补片与脱细胞猪结膜)的免疫原性。通过上述应用研究,考察GGTA1 KO小鼠评价动物源性生物材料免疫原性的可行性。3、iGb3S基因敲除小鼠的制备和免疫学特性研究利用细菌染色体同源重组技术制备iGb3S基因敲除(KO)小鼠。采用southern bolt鉴定小鼠基因型的变化。取iGb3SKO小鼠的主要脏器组织,提取mRNA,采用RT-PCR法鉴定iGb3S KO小鼠表型的变化。采用Gal抗原含量标准化检测方法检测iGb3S KO小鼠的主要脏器组织的Gal抗原含量。采用兔血红细胞(外来抗原)免疫刺激iGb3S KO小鼠,考察小鼠体内总抗体及其亚型,以及抗Gal抗体表达水平的变化。4、GGTA1/iGb3S双基因敲除小鼠的制备及免疫学特性研究通过将GGTA1 KO小鼠与iGb3S KO小鼠进行交配,筛选GGTA1/iGb3S双基因敲除(DKO)小鼠的纯合子。采用southern bolt鉴定小鼠基因型的变化。取小鼠的主要脏器组织,提取mRNA,采用RT-PCR法鉴定小鼠表型的变化。采用Gal抗原含量检测标准化方法检测纯合子GGTA1/iGb3SDKO小鼠主要脏器组织的Gal抗原含量。采用兔血红细胞(外来抗原)免疫刺激GGTA1/iGb3S DKO小鼠与GGTA1 KO小鼠,通过比较两种小鼠体内抗Gal抗体表达水平、细胞因子表达水平与淋巴细胞亚型的变化,考察两种Gal抗原缺失小鼠的免疫学特性差异,评价GGTA1/iGb3SDKO小鼠的应用前景。[结果]1、建立了动物源性生物材料Gal抗原含量检测标准化方法(YY/T 1561-2017)。研制了均一性及稳定性良好的Gal抗原阳性生物材料参考品的国家标准物质(编号380001-201701)。利用标准化方法检测牛源生物骨修复材料、牛心包来源组织修复补片与脱细胞猪结膜的Gal抗原含量分别为(3.61±0.33)×1012个/mg(干重)、(1.13±0.44)×1014个/mg(干重)、(1.85±0.09)×1013 个/mg(干重);相应的Gal抗原清除率(相对于原材料)分别为55.6%,82.4%与99.8%。Gal抗原阳性生物材料参考品的定值为:(1.733±0.437)×1014个/mg。2、成功构建了 GGTA1 KO小鼠,并建立了种群,完成了保种。证实了 GGTA1基因是调控合成Gal抗原的主要基因,引起Gal抗原表达下降约97%～99%。GGTA1 KO小鼠在兔血红细胞(外来抗原)刺激后,特异性抗Gal抗体水平显著升高,证明GGTA1 KO小鼠是评价Gal抗原为主的异种抗原特异性免疫学反应的敏感模型。应用研究结果显示:GGTA1 KO模型小鼠分别皮下植入去除抗原后的动物源生物材料及其未去除抗原的原材料后,主要引起了小鼠体内抗Gal抗体和/或部分细胞因子表达水平的特异性升高,未去除抗原的原材料组显著高于去除抗原组,说明GGTA1 KO小鼠能够敏感地反映动物源材料中残留Gal抗原的剩余免疫原性风险。3、成功构建了 iGb3S KO小鼠,并建立了种群,完成了保种。在国际上首次证实了 iGb3S基因参与了小鼠Gal抗原的合成,引起Gal抗原表达下降约5%～21%;iGb3S KO小鼠在兔血红细胞(外来抗原)刺激后,总抗体及抗Gal抗体水平未见显著升高,没有引起免疫学反应的变化。4、获得了 GGTA1/iGb3S DKO小鼠,检测其主要脏器的Gal抗原均未见表达,GGTA1与iGb3S是Gal抗原合成的两个调控基因,两个基因同时敲除可以实现Gal抗原100%的消失。GGTA1/iGb3S DKO小鼠和GGTA1 KO小鼠的对比研究结果显示:在兔血红细胞刺激2次后,抗Gal抗体表达水平均显著升高,淋巴细胞亚型及细胞因子表达水平均未见明显变化;未见GGTA1/iGb3S DKO小鼠较GGTA1 KO小鼠对兔血红细胞的刺激更敏感。说明GGTA1/iGb3S DKO小鼠和GGTA1 KO小鼠都是评价Gal抗原为主的异种抗原反应和剩余异种免疫排斥风险的敏感模型。[结论]1、本研究建立了动物源性生物材料Gal抗原含量检测标准化方法,同时成功研制Gal抗原阳性生物材料参考品及Gal抗原阴性生物材料参考品。2、本研究成功构建了 GGTA1 KO小鼠,证实了 GGTA1基因是参与调控小鼠Gal抗原合成的主要基因,GGTA1 KO小鼠对兔血红细胞等外来抗原的刺激表现出很强的敏感性。证实了 GGTA1 KO模型小鼠可用于评价动物源性生物材料的免疫原性风险,其中抗Gal抗体与细胞因子可作为特异性评价指标。3、本研究成功构建了 iGb3S KO小鼠,证实了 iGb3S基因是参与调控小鼠Gal抗原合成的次要基因,iGb3S KO小鼠对兔血红细胞等外来抗原的刺激不敏感。4、成功获得了 GGTA1与iGb3S双基因敲除小鼠,证实了 GGTA1与iGb3S同时敲除可引起小鼠主要脏器Gal抗原表达的完全缺失。GGTA1/iGb3S DKO小鼠对兔血红细胞等外来抗原的刺激表现出很强的敏感性,是评价动物源性生物材料免疫原性风险的合适动物模型,但未见GGTA1/iGb3S DKO小鼠较GGTA1 KO小鼠对兔血红细胞的刺激更敏感。