光暗循环作为昼夜节律的主要授时因子,在昼夜节律的研究中具有重要的节律牵引(Entrainment)作用,同时昼夜节律对生物体的生命活动及生命健康具有较大影响,由此开展的光暗循环对衰老影响的研究受到越来越多研究者的关注。本文以水生甲壳动物蚤状溞(Daphnia pulex)为研究对象,通过记录其在不同光暗循环下的生命表数据,检测蚤状溞氧化物产生与抗氧化系统激活情况,获得了不同光暗循环下蚤状溞的生命周期特征、体内氧化与抗氧化平衡的荧光图像以及ROS水平的定量检测结果和抗氧化酶基因的表达。通过选择Erk通路和碱基修复基因作为两个主要方向,探究了不同光暗循环对蚤状溞生长、寿命相关通路和碱基修复的影响。克隆并得到了蚤状溞Ras1、Ras2、Raf、Mek和Msh2及XRCC5基因,分析了这些基因的序列和对应氨基酸的特征,总结了其在氨基酸结构和进化上的特点。不同光暗循环下的基因表达结果展示了连续四个世代蚤状溞对其所在环境的响应。结果可为深入研究蚤状溞生物钟调节以及蚤状溞的节律性适应提供基础生物学资料。主要研究结果如下:1.光暗循环对蚤状溞生命表及氧化-抗氧平衡的影响本文设置L/D16:8、L/D8:16、持续光照(LL)和持续黑暗(DD)四个不同的光暗循环组,将孤雌幼溞分别在以上四个条件下培养,根据记录的数据绘制出蚤状溞个体在不同光暗循环下随日龄增长的体长、蜕壳、繁殖情况以及寿命图表。另外,每隔4 h收集一次各组中培养至第5天的蚤状溞用于ROS的定性和定量检测、抗氧化酶基因表达分析及抗氧化酶活性检测。结果表明,L/D16:8、L/D8:16、LL和DD组中蚤状溞的平均寿命依次为43天、48天、36.5天和40.5天,其中L/D8:16中的蚤状溞寿命最长,LL组中蚤状溞寿命最短,且蜕壳、繁殖次数、繁殖量等与寿命呈正相关。蚤状溞体内氧化与抗氧化平衡的昼夜变化是机体生理过程与生化反应的复杂结果。ROS的含量与抗氧化酶基因的mRNA水平呈现负相关。同时,食物供给可能是无光暗循环时提示蚤状溞产生特定生物节律的因素。ROS荧光检测显示胸肢上的鳃、直肠和孵育囊是蚤状溞ROS较为集中的器官。2.光暗循环对四个世代蚤状溞Erk通路基因的影响为研究蚤状溞Erk通路基因的序列和其在连续世代中的表达情况,本文对Ras1、Ras2、Raf和Mek基因进行克隆和序列分析。同时将蚤状溞分别置于L/D16:8,L/D8:16,LL及DD四个条件下培养到第5天和第25天进行取样,进行RNA提取和基因表达分析。结果表明,Ras1和Ras2蛋白均存在相同的负责结合或催化GTP水解的RAS结构域,分别位于氨基酸序列的1-166和11-177处。Ras1与Ras2蛋白最为保守,甚至其氨基酸数目在物种间也基本相似。无脊椎动物中的Ras1蛋白与脊椎动物的H-Ras同源,无脊椎动物的Ras2蛋白与脊椎动物的R-Ras同源,且Ras1与Ras2沿着各自的方向演化。Raf蛋白包含丝氨酸/苏氨酸激酶、丝裂原活化蛋白激酶激酶的催化结构域、蛋白激酶结构域等较多结构域。这些结构作为信号转导途径的重要信号分子进一步将信号传递到下游蛋白。Raf蛋白在物种间的保守性较通路中的其他蛋白低。Mek作为Raf的下游蛋白同属于PKc_like超家族。此外,在Mek的结构域中还发现双特异性蛋白激酶和丝裂原活化蛋白(MAP)\细胞外信号调节激酶(Erk)的催化结构域PKc_MEK。蚤状溞Mek蛋白同样较为保守,在进化上与昆虫更为相近。蚤状溞连续四个世代在不同光暗循环下的Erk通路基因表达结果显示,Erk通路在各组中均呈现信号逐级放大的特点,且光照时长增加会增强Erk信号通路的级联放大作用,若黑暗时长增加,此效率也随之降低。同时Erk的逐级调控随衰老而减弱。3.光暗循环对蚤状溞碱基修复相关基因的影响为揭示蚤状溞碱基修复基因的功能和其在不同光暗循环下的表达情况,本文对Msh2基因和XRCC5基因进行克隆和表达分析。同样将蚤状溞分别置于L/D16:8,L/D8:16,LL及DD四个条件培养到第5天和第25天进行取样,进行RNA提取和基因表达分析。结果表明,Msh2基因属于MutS超家族,含有MutS_I和MutS_II等与DNA错配修复相关的一系列结构域,多序列比对结果表明,Msh2蛋白在脊椎动物之间的保守性较高于无脊椎动物,具有较多完全相同的序列,同时Msh2蛋白在物种中具有相差不大的氨基酸数目。在进化上,Msh2蛋白与同类动物的亲缘关系较近,同源性较高。这也是Msh2基因在甲壳动物中的首次报道。另外,根据本文的分析,所获得的XRCC5基因可能是该基因的部分或通过可变剪接的cDNA序列,尽管与已报道的大型溞同源性达到90.98%。表达分析结果表明,光照会促进单一世代蚤状溞衰老相关的Msh2基因表达。在连续世代中,光照时长的增加使Msh2基因随衰老而上调,黑暗时长增加使该基因随衰老而下调,且这种上调或下调随世代的增加而增加。蚤状溞连续四个世代对环境中较多的光照时间表现出先增高后降低的适应情况,对于黑暗时间较长的环境,蚤状溞则会持续下调Msh2和XRCC5基因。此外,每个世代蚤状溞的XRCC5基因表达量随衰老而升高。