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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃恶性肿瘤的发生也密切相关，且多数国家和地区人群Hp感染率高达50％以上。临床上常用抗生素治疗Hp的感染，但存在再次感染、药物副作用和费用较高等问题。接种Hp疫苗是预防和控制Hp感染最为有效的措施，基因工程亚单位疫苗应是Hp疫苗研制的主要方向。 鞭毛是Hp定植及持续感染的首要条件之一，可使Hp在粘性环境中也表现出很强的移行能力，还能诱导促炎细胞因子IL-8的分泌及增强Hp感染部位的炎症反应。鞭毛蛋白由两个鞭毛素基因(flaA和flaB)编码的FlaA、FlaB蛋白多聚体组成。 本文采用高保真PCR从临床分离菌株HpY06中分别扩增全长的flaA和flaB基因，T-A克隆测序后构建原核表达系统pET32a(+)-flaA-BL21DE3和pET32a(+)-flaB-BL21DE3，用不同浓度的IPTG诱导FlaA、FlaB融合蛋白表达，SDS-PAGE检测FlaA、FlaB融合蛋白分子量，并用western blot、免疫双扩散试验和ELISA试验证实了融合蛋白的抗原性和免疫反应性。其产物将作为Hp基因工程疫苗及诊断试剂盒的抗原。 实验方法 1．幽门螺杆菌的培养： 将本室保存的HpY06、HpNCTC11637菌株涂布于Hp选择性平板培养基上，微需氧环境37℃培养5d，凡能在Hp选择性培养基上生长、针尖样透明菌落、革兰氏阴性细小弯曲杆菌、快速尿素酶试验阳性、氧化酶试验阳性、能与Hp全菌抗体 浙江大学硕士学位论文 梁韶晖发生凝集者鉴定为HP。2．幽门螺杆菌模板DNA制备： 采用常规的苯酚一氯仿法提取 Hp Y06、HpNCTCll637株 DNA，经无 DNA酶的RNA酶消化后，再次用苯酚一氯仿法提取的DNA溶于TE缓冲液中，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。3．PCR扩增： 根据HP flPA和 flaB参考核昔酸序列和表达载体克隆位点内切酶图谱分析结果，自行设计引物，由上海博亚生物技术有限公司（BioAsia）合成。FlaA基因引物序列女下：上游5’－CC－TGGCTTTTCAGGTCAA－3’（EC。R V）， 下游 5’－CC－AACTAAGTTAAAAGCC－3‘（Xh。I）。FI＊基因引物序列如下：上游 5’－CCGGAATTCATGAGTTTTAGGATAAA－3‘（Ec。RI）， 下游 5‘－CC－TGTTATTGTAAAAGCC－3‘（Xh。I）。采用上海博彩生物科技有限公司（BBST）Pfu－Taq混合高保真PCR试剂盒扩增门、flaB基因，PCR反应总体积为 100卜1，引物浓度为 250 nmol／L，100 ng DNA模板。PCR反应参数：94C5min，XI；94C305，52C305，72t90s，X 10；94oC305，52oC305，72C1005（以后每循环增加 105），X15；72’C10min，XI。1．5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。4．T十克隆、测序与表达载体的构建： 采用BBST公司的T七克隆试剂盒将扩增的目的片段克隆至pUCm刁载体中，转化于巳 col DH 5 a株并扩增，碱变性法提取质粒。获得满意的测序结果后，分别扩增含 pUCm－T－fi8A、pUClllT－f18B和 pET32。（＋）的【。。h DH 5 Q，提取质粒后用双酶切获得目的基因片段与pET32a卜）连接后转化于E．colt BLZIDE3，扩增、提取质粒后再次测序，并分别与报道的3个flaA基因核苦酸序列州，NC000921，X60746）和4个flaB基因核苦酸序列（NC00091，NC000921，L08907，AF479024）进行同源性比较。5．重组蛋白表达与纯化： pET32a （＋）fla－BLZIDE3和pET32a（＋厂flaB－BL21DE3分别在含1．0、0．5和 2 浙江大学硕士学位论文 梁韶晖0．1。OI／L IPTG的n培养基中震荡培养，诱导温度为37’C；IPTG诱导产物用超声波破碎，5000 r／min4t离。G’ 10 min后分别取上清和沉淀：采用 8％ SDS－PAGE检查目的蛋白的表达情况。用 NTA亲和层析法（BBST）收集表达的目的蛋白。6．重组蛋白免疫反应性和杭原性研究： 以兔抗Hp全菌抗体＊）为一抗、HRP标记的羊抗兔IgGUackson ImmunoResearch）为H抗，用western bolt检狈重组＊毗和FlaB 蛋白的免疫反应性。用 NTA亲和层析法mBST）收集表达的目的蛋白免疫家兔，用免疫双扩散试验检测重组FlaA、FlaB蛋白的抗原性。7．EL SA检测 20 u a加 重组 FlaA、FlaB分另包被酶标板，以 1：400稀释的患者血清为一抗、HRP标记的羊抗人 IgG为二抗、邻苯二胺为底物，显色后用酶联免疫检测仪检测490urn的吸光值，超过5份阴性血清平均OD值＋3标准差者为阳性。用蛋白含量为50 n a加 的 Hm临床菌株纯培养物超声破碎上清包被酶标板，以兔抗重组蛋白 FlaA或FlaB抗体为一抗、HRP标记的羊抗兔均G为h抗、邻苯H胺为底物，显色后用酶联免疫检测仪检测490urn的吸光值，超过5份相同包被浓度的大肠杆菌ATCC25922阴性对照平均OD值用标准差者为阳性。 结 果1．PCR 从Hp Y06株DNA模板中获得预期大刁的flaA（1533b）和flaB（1545hp）扩增条带。二．核苦酸序列分析：