前言多能淋巴干细胞迁移至胸腺,从胸腺的皮质逐渐移行到髓质,经过阳性选择和阴性选择,逐步分化成熟为T细胞。T细胞表面的抗原受体（T cell receptor）TCR有两类,一类是由α链和β链组成的TCRαβ,另一类是由γ链和δ链组成的TCRγδ。迄今为止,关于TCRγδ细胞分化成熟的过程以及生理功能、识别抗原的特点等方面还所知不多,远没有TCRαβ细胞那样详尽。γδT细胞主要分布于皮肤和粘膜组织,数量较少,但它在抵御外界病原体侵害、免疫调节和肿瘤免疫等诸多方面都有着不可替代的作用。因此,γδT细胞也引起了众多学者的关注。近几年的研究表明:γδT细胞以胸腺内和胸腺外两条途径发育。胸腺内发育的依据是应用骨髓干细胞在胸腺组织内培养可以诱导分化为γδT细胞。Ciofani M等人在2007年的研究中发现大量的胸腺衍生信号和高度保守的分化途径,促使T细胞逐步分化成熟。T细胞的发育是以级联方式有序发生的,TCR基因的启动顺序依次为TCR D（δ）-TCRG（γ）-TCRB（β）-TCRA（α）,αβT细胞的分化不可能绕过TCRD（δ）-TCRG（γ）基因的表达而直接表达αβTCR。故推测αβT细胞来自于γδT细胞,γδT细胞应处于固有免疫应答和适应性免疫应答的中间过渡阶段。过渡性免疫应答理论认为部分胸腺γδT细胞可分化为αβT细胞。我们以胎龄14.5d C57BL/6胎鼠为研究对象,采用胚胎胸腺器官培养（FTOC）、CFSE染色及流式细胞分选和检测等技术来观察胸腺γδT细胞的分化去向,为过渡性免疫应答提供科学的理论依据。实验材料一、主要试剂APC-抗CD4;PE-抗CD8;Cy5-抗CD3;CFSE;羊抗鼠的一抗sc-1778 TCRγ:IgG和Texa Red-抗TCRγ二抗;羊抗鼠的一抗sc-9101 TCRβ:IgG和Texa Red-抗TCRβ二抗;DMSO;Mtb-Ag;IL-2;培养液Ⅰ:20%胎牛血清RPMI1640;培养液Ⅱ:20%成鼠血清RPMI1640（除血清不同外,两种培养液其他成分相同）等。二、主要仪器体视显微镜;流式细胞仪;荧光显微镜;显微外科镊、剪;CO₂恒温培养箱;倒置显微镜;台式离心机;小离心机;超净空气净化台;酶标仪;超声波细胞破碎仪80W等。三、试验动物SPF级14.5d C57BL/6孕鼠（雌雄比例为2:1,晚8点合笼过夜,第二天检查出现阴道栓的为第0.5d）。C57BL/6小鼠（5-6周龄）购于中国医学科学院北京试验动物中心,许可证编号:SCXK（北京）2004-0001。实验方法一、体外胚胎胸腺器官培养（FTOC）方法的建立将无菌明胶海绵置于24孔板中,将经消毒处理过的无菌0.8μm微孔滤膜（剪成直径约1ml的圆形）置于凝胶海绵上。分为两个实验组,第Ⅰ组加1ml的培养液Ⅰ;第Ⅱ组加1ml的培养液Ⅱ。无菌取胎龄14.5d C57BL/6胎鼠胸腺,随机分别放置在浸于不同培养液中的滤膜上,一个胎鼠的两个胸腺小叶放入不同的实验组,每孔4个小叶。胚胎胸腺器官保持在气液界面中,置37℃,5%体积分数CO₂孵箱孵育,每隔3d更换培养液。隔天检测胚胎胸腺细胞亚群随体外培养时间延长的变化。二、不同胎龄胎鼠体内胸腺细胞表达γδTCR的时相采用荧光抗体标记、流式检测技术,分别检测12.5d、13.5d、14.5d、15.5d、16.5d各胎龄C57BL/6胎鼠体内胸腺细胞表达γδTCR的时相。三、刺激因素的浓度及其促进增殖的时相刺激因素包括Mtb-Ag和IL-2。制备C57BL/6小鼠胸腺单细胞悬液,接种到2块96孔培养板中,分为实验组和对照组,实验组分别加入5μg/ml、7μg/ml、9μg/ml三个不同浓度的刺激因素（Mtb-Ag）10μl,对照组加入等量的等渗0.1M的PBS。置37℃、5%体积分数CO₂孵箱孵育,继续孵育。在第3、6d,采用MTT比色法观察不同浓度的Mtb-Ag对C57BL/6小鼠胸腺细胞的增殖变化。以刺激因素的最佳浓度和14.5d胎龄C57BL/6小鼠胸腺单细胞悬液体外共培养,分别于第0、2、4、6、8 d标记γ链荧光抗体,检测胸腺γδT细胞的增殖时相。四、纯化胸腺γδT细胞与CFSE染色制备14.5d胎龄C57BL/6小鼠胸腺单细胞悬液,体外应用刺激因素培养2d后,标记γ链荧光抗体,进行流式分选纯化,然后以CFSE最佳浓度染色。五、胸腺γδT细胞的分化去向排除γ链荧光抗体的干扰作用,将FCSE染色的胸腺γδT细胞加入胚胎胸腺器官的滤膜上进行孵育,分别在第5、8d加入抗β链的荧光抗体,流式检测其分化去向。六、统计学分析实验数据采用均数±标准差表示,组间差异比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA）,用SPSS16.0软件完成。P<0.05有显著性差异。结果FTOC系统中使用培养液Ⅰ能更好的接近于体内前体T细胞的发育过程;14.5d胎龄小鼠体内胸腺细胞表达γδTCR为总胸腺细胞数的15.07%,和12.5d、13.5d、15.5d、16.5d胎龄小鼠体内胸腺细胞相比,所占比例最高;Mtb-Ag 7μg/ml和5μg/ml、9μg/ml相比较对小鼠胸腺细胞的增殖有明显的促进作用（p<0.05）;加入适宜浓度的刺激因素,体外培养第2d胸腺γδT细胞增殖达到高峰;用于分选的胸腺细胞的浓度为1×10⁷个/ml共1ml,分选的阳性细胞为3%;30μm的CFSE是最佳试验浓度;第5d由CFSE染色的胸腺γδT细胞分化为αβT细胞的分化率为8.12%,第8d为3.36%。讨论分子遗传学研究证明,在胚胎期多能淋巴干细胞进入胸腺时,其受体基因还未发生重排,胚胎14.5d发现重排的TCRγ转录达高峰,TCRβ基因开始重排,TCRα基因重排晚于TCRβ基因2d。07年有学者发现TCRγ、δ主要在胚胎胸腺未成熟的T细胞膜上表达,而TCRα、β主要在成熟T细胞膜上表达。14.5d胎鼠胸腺T细胞基本处于原始、未成熟阶段,取其进行体外培养,随着体外培养时间的推移,T细胞通过阳性和阴性选择,不断地分化为CD4⁺CD8⁺细胞,并进一步分化成熟为CD4⁺CD8^-和CD4^-CD8⁺细胞,待体外胸腺培养8d后已有相当数量的T细胞分化成熟为单阳性细胞。故14.5d胎龄鼠的胸腺细胞是进行胸腺细胞发育研究的最佳起始时间。因此,本实验选用14.5d胎鼠胸腺器官采用FTOC技术进行体外培养。在培养液的液相中我们发现大量的CD4⁺CD8⁺双阳性细胞输出胸腺,其机制还不明确,但为我们输入CFSE染色的胸腺γδT细胞提供了胸腺空间微环境,在此环境中,CFSE染色的胸腺γδT细胞在第5、8d分化为αβT细胞的分化率分别为8.12%[812/（1×10⁴个/ml×0.1ml）]和3.36%[336/（1×10⁴个/ml×0.1ml）]。07年有学者研究发现胚胎猪胸腺的CD4⁺γδT细胞代表过渡状态和独立亚型,不输出胸腺;胸腺CD4⁺γδT细胞能在适当的培养条件下分化为TCRαβ细胞,这也为过渡性免疫应答提供了科学的理论依据。结论经纯化与CFSE染色的14.5d胎鼠胸腺γδT细胞在体外胚胎胸腺器官中孵育可分化为αβT细胞。