【摘 要】
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目的验证阿米替林（Amitriptyline,AMI）减轻利多卡因（Lidocaine,Lido）的神经毒性作用,并探讨其可能机制。方法1.构建利多卡因损伤SH-SY5Y细胞模型:体外培养SH-SY5Y细胞,采用CCK-8法检测细胞活力,确定利多卡因的适宜浓度,建立利多卡因神经毒性模型2.验证对利多卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤有保护作用的阿米替林浓度。3.在2 m M Lido干预细胞24 h
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目的验证阿米替林（Amitriptyline,AMI）减轻利多卡因（Lidocaine,Lido）的神经毒性作用,并探讨其可能机制。方法1.构建利多卡因损伤SH-SY5Y细胞模型:体外培养SH-SY5Y细胞,采用CCK-8法检测细胞活力,确定利多卡因的适宜浓度,建立利多卡因神经毒性模型2.验证对利多卡因诱导的SH-SY5Y细胞损伤有保护作用的阿米替林浓度。3.在2 m M Lido干预细胞24 h构建神经毒性细胞模型前,使用100 n M的AMI预处理细胞24小时。CCK-8法检测细胞存活率的影响,相差显微镜下观察细胞生长状态与形态改变,TUNEL/DAPI荧光染色技术测定细胞凋亡率。4.分别使用2 m M自噬抑制剂3-MA、200 n M自噬激动剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA）预处理2 h调控细胞自噬水平。利用MDC自噬小体染色法检测自噬活性、Western blot检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3II/LC3I、P62、TUNE技术检测细胞凋亡情况并计算细胞凋亡率。5.通过慢病毒介导BDNF基因敲减及过表达质粒转染SH-SY5Y细胞,Western blot检测BDNF蛋白表达;AMI（100 n M,24 h）预处理及Lido（2 m M,24h）干预后,CCK-8法测定各组细胞活力,TUNEL/DAPI荧光染色技术测定细胞凋亡率。6.稳定转染BDNF敲减及过表达的SH-SY5Y细胞株经上述药物处理后,采用MDC法观察细胞自噬活动情况并计算自噬细胞阳性率,Western blot检测细胞内自噬相关蛋白Beclin-1、LC3II/LC3I、P62以及BDNF、m TOR、P-m TOR（Ser2448）表达情况。7.稳定转染BDNF敲减及过表达的SH-SY5Y细胞株经上述药物处理后,采用MDC法观察细胞自噬活动情况并计算自噬细胞阳性率,Western blot检测细胞内自噬相关蛋白Beclin-1、LC3II/LC3I、P62以及BDNF、m TOR、P-m TOR（Ser2448）表达情况。结果1.阿米替林改善利多卡因引起的SH-SY5Y细胞损伤1)Lido呈时间、浓度依赖性引起细胞损伤;2)AMI改善利多卡因引起的SH-SY5Y细胞损伤。2.阿米替林抑制自噬缓解利多卡因引起的神经毒性1)Lido引起SH-SY5Y细胞自噬活动增强;2)AMI降低Lido引起的自噬水平;3)自噬抑制剂3-MA改善Lido引起的细胞损伤;4)自噬激活剂RAPA加重Lido引起的细胞损伤。3.阿米替林上调BDNF表达减轻利多卡因引起的神经毒性1)Lido引起SH-SY5Y细胞BDNF表达水平降低;2)AMI预处理上调SH-SY5Y细胞BDNF表达水平;3)敲减BDNF表达逆转AMI的细胞保护作用;4)过表达BDNF减轻Lido引起的细胞损伤。4.阿米替林通过上调BDNF表达介导自噬抑制从而发挥神经保护作用1)SH-SY5Y细胞内自噬活动受BDNF表达水平调控;2)BDNF通过激活m TOR通路抑制自噬。结论阿米替林能够有效减轻利多卡因神经毒性,其机制可能是通过上调BDNF表达,激活m TOR通路抑制自噬,进而减轻细胞凋亡。
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