【摘 要】
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目的STIM1在多种疾病的发生发展中扮演着重要角色,本文拟探讨STIM1在低氧和野百合碱诱导的两种大鼠肺动脉高压（Pulmonary arterial hypertension,PAH）模型中的表达,并在人肾上皮细胞系293T和大鼠动脉平滑肌细胞（Aortic smooth muscle cells）A7R5上,观察STIM1对细胞自噬与增殖的影响及可能的机制,为肺动脉高压发病机制的研究及治疗提供
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目的STIM1在多种疾病的发生发展中扮演着重要角色,本文拟探讨STIM1在低氧和野百合碱诱导的两种大鼠肺动脉高压（Pulmonary arterial hypertension,PAH）模型中的表达,并在人肾上皮细胞系293T和大鼠动脉平滑肌细胞（Aortic smooth muscle cells）A7R5上,观察STIM1对细胞自噬与增殖的影响及可能的机制,为肺动脉高压发病机制的研究及治疗提供新的思路。方法1.通过缺氧（oxygen deficit,OD）和野百合碱（monocrotaline,MCT）诱导建立大鼠肺动脉高压模型,测量右心室收缩压（RVSP）和右心室质量指数（RVMI）以及HE染色观察肺动脉血管形态来鉴定造模是否成功。2.蛋白印迹分析技术检测STIM1在肺动脉标本中表达情况。3.查找大鼠源编码的STIM1基因,设计基因特定的克隆引物,利用PCR技术扩增STIM1,并将上述的片段连接到PLV慢病毒载体中,并对PLV-STIM1重组载体进行酶切鉴定。4.在293T细胞和A7R5细胞建立STIM1过表达模型,采用蛋白印迹分析和功能性相关实验探究STIM1对细胞增殖的影响。5.在肺动脉组织、293T细胞和A7R5细胞中,采用蛋白印迹分析过表达STIM1对细胞自噬和炎症分子表达的影响。结果1.与对照组相比,OD组和MCT组大鼠的右心室收缩压（RVSP）和右心室质量指数（RVMI）升高,HE染色显示OD组和MCT组大鼠的肺动脉平滑肌增生,管壁出现增厚,提示肺动脉高压模型构建成功。2.与对照组相比,OD组和MCT组大鼠肺动脉组织的STIM1蛋白表达量显著下降。3.经双酶切鉴定,重组载体PLV-STIM1序列正确。通过观察PLV-EGFP组荧光蛋白表达情况和蛋白印迹分析,STIM1细胞过表达模型构建成功。4.在293T细胞,与对照组相比,转染PLV-STIM1后增殖相关蛋白PCNA和Cyclin D1表达量下降;通过CCK-8法检测后发现,与对照组相比,过表达PLV-STIM1可显著降低细胞的增殖能力;在平板克隆实验中,与对照组相比,转染PLV-STIM1后可显著降低细胞的克隆形成能力。在A7R5细胞,通过CCK-8法检测后发现,与对照组相比,过表达PLV-STIM1对细胞的增殖能力无明显影响。在平板克隆实验中,与对照组相比,感染PLV-STIM1后可显著降低细胞的克隆形成能力。5.在动物实验中,与对照组相比,OD组和MCT组大鼠肺动脉组织LC3表达量明显上升,Beclin-1表达量下降。在293T细胞中,与对照组相比,转染PLV-STIM1前后及EBSS和雷帕霉素处理前后自噬相关蛋白LC3表达量下降,P62表达量增加,atg12表达量下降;与对照组相比,转染PLV-STIM1后炎症相关蛋白sting表达量变化无统计意义,p-sting表达量下降,其下游蛋白TBK1表达量下降。在A7R5细胞中,与对照组相比,感染PLV-STIM1前后及巴佛洛霉素处理前后自噬相关蛋白LC3表达量下降;与对照组相比,感染PLV-STIM1后炎症相关蛋白sting表达量变化无统计意义,p-sting表达量下降,其下游蛋白NF-κB表达量下降。结论1.STIM1与肺动脉高压之间存在一定的联系。2.STIM1通过抑制细胞增殖、自噬和炎症减缓肺动脉高压进程。
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