海带渣与淀粉类真姬菇发酵多糖分离技术及生物活性解析

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作为农业大国,中国拥有丰富的淀粉类生物质资源;而海带产品加工产业的逐渐兴起也形成了大量的海带废渣,开发高效的淀粉类生物质和海带渣资源化利用途径,不仅避免海带渣对环境的潜在污染,还可以提升淀粉类生物质产业附加值。真菌多糖在医学领域的巨大应用潜力,使其成为医学和药物学研究的热点。本研究以海带渣和淀粉类生物质为基质进行真姬菇多糖发酵,研究活性多糖发酵的可行性,探索基于真姬菇多糖发酵的海带渣和淀粉类生物质资源化利用新途径,并在此基础上对真姬菇发酵产生的多糖高效制备工艺、径向色谱纯化工艺以及多糖的生物活性和构效关系进行系统研究。旨在开拓新的海带渣和淀粉类生物质资源化利用新思路,揭示多糖的药用活性与化学结构之间的内在关系。本课题首先评价了基于真姬菇多糖发酵的海带渣及淀粉类生物质资源化利用的可行性。结果表明海带渣和淀粉类生物质资源均可以作为真姬菇生长发酵的营养基质,为真姬菇深层发酵提供充足的营养成分和必要的剪切力。从发酵产物中分离的部分多糖组分具有极高的补体结合活性,单糖组成分析表明来自海带废渣发酵的活性多糖组分FSH-N主要由岩藻糖、葡萄糖和半乳糖组成;而来自淀粉类生物质发酵的活性多糖组分B-II则主要由半乳糖酸、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖构成。其次,课题以淀粉类生物质真姬菇发酵所产生的胞外多糖为材料,研究了多糖乙醇沉淀制备工艺中乙醇浓度、发酵液pH值、沉淀温度、时间和干燥温度对多糖的产量和抗肿瘤活性的影响,通过响应面优化确定最适的多糖醇沉制备工艺为乙醇浓度85.00%,发酵液pH7.70,12℃沉淀1h,40℃干燥。模型预测粗多糖产率能达到9.93g/L,对肿瘤细胞体外抑制率为84.37%,验证实验结果与模型预测值基本吻合。为了建立高效的多糖纯化工艺,本课题对适于装填在径向色谱柱内进行真菌多糖富集、纯化的树脂进行了筛选,确定了树脂D4020和DEAE-SepharoseCL-6B适合进行真菌发酵上清液多糖的富集和纯化;其次,对径向色谱柱纯化真菌多糖的条件、参数进行考察,详细对比径向色谱柱和传统轴向柱进行真菌多糖纯化的效率,并探讨了径向色谱柱线性放大的可行性,最终建立了一套完整的纯化和线性放大工艺。多糖经装填D4020的径向色谱柱富集后,总回收率达到97.51%,色素的去除率达88.9%,蛋白去除率达71.5%,多糖纯度提高3.14倍;经径向离子交换层析纯化后分为四个不同的多糖组分,总多糖回收率超过80%,且主要多糖组分纯度超过90%。此外,还证实了径向色谱柱应用于真菌多糖的富集和纯化工艺具有良好的线性放大效果,并证明径向色谱柱装填凝胶树脂能实现多糖样品的高效脱盐。本研究分别检测了纯化所获多糖的体外抗肿瘤活性、补体结合活性和巨噬细胞诱导活性,并采用GC、GC-MS等方法分析多糖化学结构。结果表明酸性多糖组分B-I具有良好的体外抗肿瘤活性,且对人正常细胞几乎无毒副作用;进一步纯化所得四种高分子量多糖尤其是组分B-II-I具有极高的补体结合活性和良好巨噬细胞诱导能力。采用GC、GC-MS等手段对活性多糖的结构分析表明中性组分B-N-I为1-4-葡聚糖;B-I-I是主链为1→2连接的甘露聚糖,并带有甘露糖残基和1→3连接的甘露糖侧链。酸性多糖组分B-II-I和B-II-II则主要由1→4连接的半乳糖酸聚糖主链构成,其中交替连有一定数量的1→2连接的鼠李糖。构效关系分析表明多糖中酸性基团的存在以及多糖的分子量会影响其生物活性,果胶多糖中典型的RG-I型区域及AG-II型结构对B-II-I发挥免疫调节活性至关重要。综上所述,本课题证实了基于真姬菇多糖发酵的海带渣及淀粉类生物质资源化利用的可行性,并确立了一种高效、低能耗的多糖乙醇沉淀制备方法,建立了一套完整的真菌多糖径向色谱富集、纯化、脱盐和放大工艺;阐述了活性多糖的生物活性和化学结构及其构效关系。本课题为海带渣和淀粉类生物质资源化提供了新的思路,也为真菌多糖制备工艺、高效纯化及放大技术、生物活性及构效关系研究提供了新的实验依据。
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