胶质瘤作为人类最常见的原发性颅内肿瘤,有很高的发病率和死亡率。约占成人颅内原发肿瘤的30%-50%。迄今的治疗方法都不能从根本上改变这一致命肿瘤的自然转归,因而新疗法的探索成为神经外科的热点课题。近年来随着胶质瘤分子生物学与分子遗传学的发展,同时基因重组、基因转染等技术的成熟,肿瘤基因治疗成为研究的热点,自杀基因治疗是其中最常采用的方案。理想的脑肿瘤的基因治疗应该是应用最佳的基因转移技术来转移最佳的治疗基因。自杀基因(HSV-tk/GCV)治疗肿瘤的体外及动物实验均取得了惊人的效果,但临床疗效不能令人满意,究其原因是基因治疗的载体无法在体内肿瘤组织中进行广泛分布,从而不能充分发挥其旁观者效应。胶质瘤患者均表现出了T淋巴细胞抗肿瘤作用的减弱,并且,由于胶质瘤细胞缺乏细胞表面抗原导致的肿瘤抗原呈递作用的减弱,进一步减弱了抗肿瘤免疫。现在的观点认为,IL-18可通过T淋巴细胞、NK细胞发挥抗肿瘤作用,并且通过上调MHC分子的表达、促进CD4+辅助性T细胞向Th1型亚单位的分化增强细胞免疫。骨髓基质干细胞(BMSCs)是具有迁移能力的细胞,并可稳定的表达外源性转染的某些基因,为胶质瘤基因治疗提供了新的思路。本实验拟用骨髓基质干细胞为载体,观察转染自杀基因的骨髓基质干细胞对脑胶质瘤的治疗作用,再引入IL-18,增强抗肿瘤免疫,观察两者相结合的治疗效果,为以骨髓基质干细胞为载体进行脑胶质瘤的基因治疗提供理论依据。以骨髓基质干细胞为载体,HSV-tk与IL-18联合治疗胶质瘤的研究,在国内外尚无报道。1.骨髓基质干细胞的培养、鉴定及标记的研究目的:研究骨髓基质干细胞的培养方法,并对其进行标记,为进一步的体内试验奠定基础。方法:将出生2周的SD大鼠脱颈处死,消毒后取双侧股骨,自中间剪断后冲出骨髓细胞,加入含20%胎牛血清的完全培养液于37℃、5%CO2孵箱内培养,48小时后半量换液。以后每2-3天半量换液,7-8天传代一次。培养初期细胞较混杂,第6代后细胞形态为均一的纺锤形细胞。MTT法绘制生长曲线。将培养第6代、已纯化的骨髓基质干细胞消化、计数后应用流式细胞术检测BMSCs CD31、CD34、CD45、CD90、CD44、CD71阳性率。取对数生长期的骨髓基质干细胞进行细胞爬片,待细胞生长至50%时加入BrdU(终浓度10μg/ml),24小时后取出玻片用PBS洗涤,4%多聚甲醛固定15分钟后进行免疫组化及免疫荧光染色,封片观察。将BrdU标记的骨髓基质干细胞注入大鼠颅内,3周后处死大鼠取脑,于穿刺点位置附近作石蜡切片并进行免疫荧光染色。结果:在培养初期可见大量悬浮细胞,48小时后可见有散在纺锤形贴壁细胞,经多次半量换液后,未贴壁细胞逐渐被去除。细胞初期多以集落形式生长,第6代后细胞呈形态均一的纺锤形,分布均匀。绘制细胞生长曲线,可见细胞呈一种持续的增殖状态,培养2-3天后进入对数生长期。以流式细胞技术检测细胞表面抗原,结果显示为体积均一的细胞群, CD31、CD34、CD45的阳性率分别为5.67%、4.31%、4.42%, CD90、CD44、CD71的阳性率分别为97.17%、98.63%、95.86%。骨髓基质干细胞体外免疫组化显示88.75±4.38%的细胞可被BrdU标记。免疫荧光染色可见胞核染色明显,BrdU标记的骨髓基质干细胞注入体内后3周仍可见明显的BrdU着色,穿刺点位置可见密集的细胞。结论:通过骨髓全细胞培养的方法可获得高纯度的BMSCs,并可在体外长期培养;采用BrdU标记骨髓基质干细胞具有较高的标记阳性率,并且标记效果稳定。2.骨髓基质干细胞向脑胶质瘤的趋向性及神经转化潜能目的:在于研究骨髓基质干细胞向脑胶质瘤的趋向性,及骨髓基质干细胞在体外环境中、在特定细胞因子诱导条件下的细胞转化,以及骨髓基质干细胞在脑胶质瘤环境中的转化情况。方法:体外培养6~7代的BMSCs接种到预置有多聚赖氨酸包被的盖玻片的培养板内,细胞达到70%融合时,将盖玻片转移至含10%胎牛血清的Neurobasal培养基内培养,加入全反式视黄酸(0.5μmol/L)、脑源性神经生长因子(10ng/mL)。以正常培养的、未加诱导剂的BMSCs作为对照。4d后,取出盖玻片,4%多聚甲醛固定30min,用于免疫荧光检测细胞转化情况。骨髓基质干细胞趋瘤性研究的体外实验采用空心柱试验及Transwell试验。培养大鼠脑胶质瘤C6细胞,待细胞达到对数生长期时,消化计数,制作大鼠脑胶质瘤模型。模型建立3天后随机抽取20只荷瘤大鼠,在肿瘤对侧大脑立体定向种植BMSCs(8×10~4个悬于2μL PBS)。移植后15d,4%多聚甲醛自大鼠心脏灌注后,取出脑组织制作病理切片。用于转化研究的脑组织制作冰冻切片。结果:经诱导剂诱导转化3天后,在倒置显微镜下观察,细胞形态改变明显,部分细胞可伸出长的突起,少数突起可与周围的细胞或突起有紧密的接触,另有少部分细胞变圆、脱落;对照组中培养的BMSCs细胞形态未见明显变化。免疫荧光染色显示:在诱导组,GFAP阳性率21.1±6.3%,MAP2阳性率56.4±13.8%,Nestin阳性率8.3±5.2%;在对照组,未发现MAP2、Nestin阳性细胞,GFAP阳性率3.9±2.8%。空心柱试验显示,随着培养时间的延长,BMSCs很快离开原种植位置,向C6细胞存在位置进行迁移,而后广泛迁移到胶质瘤细胞区域,而3T3细胞仍停留在原位。Transwell试验显示无细胞的培养液(1.1±0.7)和3T3细胞条件培养液(2.4±0.9)的培养孔仅有极个别的BMSCs迁移,两者之间无统计学差异(P>0.05),在C6细胞条件培养液(14.7±4.7)的培养孔有明显的BMSCs迁移,而更大的迁移细胞数是在C6细胞的培养孔(42.7±8.2)。BMSCs在细胞因子条件下的迁移: PDGF诱导的迁移细胞数量最多(32.7±6.3),其次是EGF(26.3±7.4)。b-FGF(7.5±2.8)和VEGF(9.4±3.5)诱导的迁移细胞最少,两者无统计学差异(P>0.05)。在所有诱导因素中,C6细胞诱导了最明显的迁移(P<0.05)。体内趋瘤性试验显示,有大量的BrdU标记的BMSCs位于正常脑组织与肿瘤的交界位置,而在肿瘤内部只有少许BMSCs。体内转化的免疫荧光染色显示:脑内移植的用Hoechst33258标记的BMSCs部分呈Nestin阳性(8.32±3.41%),部分呈GFAP阳性(32.71±8.66%),部分呈MAP2阳性(11.88±5.16%)。提示移植的部分BMSCs可转化为神经前体细胞,部分可转化为神经元或胶质细胞(Fig7)。对照组2、对照组3中,移植BMSCs的GFAP阳性率分别为31.19±8.76%和29.32±7.75%, Nestin阳性阳性率分别为6.95±3.75%和7.21±3.31%,MAP2阳性率分别为8.76±3.77%和10.59±5.43%,三组间比较无统计学差异(P>0.05)。结论:骨髓基质干细胞具有明显的向胶质瘤细胞迁移的特性,迁移细胞多聚集于肿瘤边缘,只有少数骨髓基质干细胞可达到肿瘤内部;骨髓基质干细胞在体外特殊诱导环境中及移植到荷瘤大鼠脑内后,可部分转化为神经前体细胞、神经元及胶质细胞。3.转染HSV-tk的骨髓基质干细胞治疗脑胶质瘤的体内、外实验研究目的:在于探讨以骨髓基质干细胞为载体,观察转染tk基因的骨髓基质干细胞对脑胶质瘤的杀伤作用。方法:AdCMV-tk病毒扩增后用于感染骨髓基质干细胞,而后采用RT-PCR方法检测BMSCs/tk对tk基因的转录。而后进一步采用流式细胞术、MTT检测BMSCs/tk细胞表面抗原及生长曲线。Transwell试验检测BMSCs/tk体外趋瘤性;制作大鼠脑胶质瘤模型,将BMSCs/tk移植到肿瘤对侧脑组织,观察其体内趋瘤性。将BMSCs/tk与C6细胞混合培养,采用不同的效靶比及不同的GCV浓度,用MTT法、TUNEL、AnnexinV检测细胞存活率或凋亡率,观察BMSCs/tk的旁观者效应。进一步采用体内试验,观察BMSCs/tk的体内旁观者效应,观察荷瘤大鼠在治疗后的生存期改变。结果:BMSCs/tk的细胞表面抗原、细胞生长曲线、体内外趋瘤性仍保持着BMSCs的特性。RT-PCR显示,AdCMV-tk腺病毒感染BMSCs后24小时即有明显的tk基因的转录,在48小时达到高峰,而后逐渐降低,在1个月时仍有少量tk基因转录。体外旁观者效应检测显示,随着效应细胞数量的增多,杀伤效果明显增强;随着GCV用量的增多,杀伤效果明显增强。体内试验显示,应用TUNEL法检测BMSCs/tk的体内抗脑胶质瘤作用,对比平均每个视野中肿瘤细胞的凋亡数,BMSCs/βgal组(1.65±1.09)、BMSCs组(1.50±1.43)、PBS组(1.45±1.28)及空白对照组(1.30±1.08)之间无明显差异(P>0.05),但均明显低于BMSCs/HSV-tk组(8.85±3.33) (P<0.05)。结论:感染AdCMV-tk后, BMSCs可长时间的对tk基因进行转录;BMSCs/tk具有明显的颅内肿瘤趋向性,并保持旺盛的增殖活性;BMSCs/tk在体外及在脑胶质瘤荷瘤大鼠体内可诱导明显的肿瘤细胞凋亡,延长荷瘤大鼠生存期。4. HSV-tk、IL-18联合修饰骨髓基质干细胞治疗脑胶质瘤的体内、外实验研究目的:是采用IL-18转染BMSCs,观察BMSCs/IL-18的抗脑胶质瘤效果;进一步采用IL-18及tk联合修饰BMSCs,观察BMSCs/IL-18/tk的体内外抗肿瘤效果。方法:LXSN/IL-18感染骨髓基质干细胞(BMSCs/IL-18),筛选出阳性克隆后,感染AdCMV/tk病毒(BMSCs/IL-18/tk),而后采用RT-PCR方法检测BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk对IL-18基因、tk基因的转录。而后进一步采用流式细胞术、MTT检测BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk细胞表面抗原及生长曲线。Transwell试验检测BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk体外趋瘤性;制作大鼠脑胶质瘤模型,将BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk移植到肿瘤对侧脑组织,观察其体内趋瘤性。将BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk与C6细胞混合培养,采用不同的效靶比及不同的GCV浓度,用MTT法、TUNEL、AnnexinV检测细胞存活率或凋亡率,观察BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk的旁观者效应。进一步采用体内试验,观察BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk的体内抗脑胶质瘤作用。ELISA法检测BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk对淋巴细胞分泌的影响。免疫组化方法检测BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk治疗后肿瘤组织内部微血管密度、淋巴细胞浸润、细胞凋亡情况。MRI检测治疗后的肿瘤体积改变,观察荷瘤大鼠在治疗后的生存期改变。结果:BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk的细胞表面抗原、体内外趋瘤性仍保持着BMSCs的特性。细胞生长曲线显示,BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk增殖活性有所下降。RT-PCR显示,BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk可稳定转录IL-18基因, BMSCs/IL-18 /tk可较长时间稳定的转录tk基因,免疫组化显示BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk稳定表达IL-18。体外研究显示,BMSCs/IL-18/tk可产生明显的旁观者效应,且随着效应细胞数量的增多,旁观者效应更加明显,而BMSCs/IL-18未表现出旁观者效应。ELISA法检测显示,BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk可明显增加体外淋巴细胞分泌IFN-γ,并可增加荷瘤大鼠体内血清IFN-γ浓度。体内试验显示,BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk可明显增加荷瘤大鼠脑内胶质瘤肿瘤组织中淋巴细胞浸润数量,减少肿瘤微血管密度,诱导肿瘤细胞凋亡。BMSCs/IL-18/tk可明显延长荷瘤大鼠的生存期。结论:转染IL-18后,BMSCs/IL-18可稳定转录及表达IL-18基因;感染AdCMV-tk后,BMSCs/IL-18/tk可稳定的转录tk及IL-18; BMSCs/IL-18、BMSCs/IL-18/tk具有明显的颅内肿瘤趋向性,表达BMSCs特异性的表面抗原,保持旺盛的增殖活性;BMSCs/IL-18/tk在体外及在脑胶质瘤荷瘤大鼠体内可诱导明显的肿瘤细胞凋亡,减少肿瘤组织微血管密度,增加CD4~+、CD8~+淋巴细胞的浸润数量,延长荷瘤大鼠生存期。