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1、研究背景胶质瘤是临床最常见的中枢神经系统肿瘤,胶质母细胞瘤患者5年生存率低于5%。胶质瘤是一种高度恶性、呈浸润性生长的肿瘤,与周围正常脑组织分界不清,并易于复发,故临床疗效不理想。当前国内外针对胶质瘤治疗的方案是通过手术最大范围的切除病灶,同时联合放疗及替莫唑胺等药物化疗,该治疗方案提高了胶质瘤患者的生活质量并延长了生存期,但高级别胶质瘤患者的预后并没有得到明显改善,并产生对化疗药物的耐药。因此迫切需要寻找胶质瘤治疗的新靶点。甲状腺激素受体相互作用分子13（TRIP13）是一种AAA+ATP酶,最早在小鼠中发现与有丝分裂检查点相关。研究表明TRIP13在多数正常组织中低表达,在多种恶性肿瘤组织中高表达,如结肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和头颈癌等。TRIP13能够促进结肠癌细胞迁移和增殖,促进头颈癌和非小细胞肺癌增殖和侵袭。文献报道,TRIP13参与调控肿瘤细胞有丝分裂与DNA损伤修复,在肿瘤细胞周期调控中发挥了重要作用。但是TRIP13在胶质瘤细胞中的作用和机制尚不明确。通过对TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库分析发现,高表达TRIP13的胶质瘤患者生存率显著降低,提示TRIP13是潜在的胶质瘤致癌基因。多项研究显示,表皮生长因子受体（EGFR）在多数胶质瘤患者中特异性扩增,EGFR扩增及突变是胶质瘤患者死亡的重要原因。初步研究发现TRIP13与EGFR有相互作用,提示TRIP13可能通过EGFR通路调控胶质瘤发生发展。本课题研究TRIP13在胶质瘤细胞中的作用及其作用机制,为胶质瘤靶向治疗提供新的思路。2、研究方法（1）对数据库GSE4271＿U132A进行分析,比较TRIP13表达与胶质瘤患者生存率的相关性。对80例不同病理级别的胶质瘤切片进行免疫组织化学分析,检测TRIP13的表达差异。Western Blot检测TRIP13在胶质瘤细胞中的表达情况。激光共聚焦显微镜检测TRIP13在不同肿瘤细胞中的定位。（2）利用慢病毒构建稳定敲低或过表达TRIP13的细胞株。Transwell侵袭实验和鸡胚侵袭模型检测TRIP13对胶质瘤细胞侵袭能力的影响。克隆形成实验分析TRIP13对胶质瘤细胞增殖能力的影响。体外微球体培养实验检测TRIP13对胶质瘤细胞成球能力的影响。Western Blot检测TRIP13对胶质瘤细胞中干性标记蛋白表达的影响。（3）通过Human Phospho-Kinase Array试剂盒检测TRIP13在胶质瘤细胞中调控的信号通路。利用Western Blot检测EGF刺激条件下TRIP13对EGFR通路蛋白表达的影响。Real-time PCR实验检测TRIP13对EGFR m RNA表达的影响。（4）利用免疫共沉淀实验检测TRIP13与EGFR的相互作用,TRIP13对内源EGFR泛素化水平的影响,EGFR对TRIP13的磷酸化。利用激光共聚焦显微镜检测TRIP13与EGFR在胶质瘤细胞内的共定位。（5）利用ELISA试剂盒检测细胞上清中趋化因子CXCL6的表达差异。（6）通过CCK8检测奥西替尼在胶质瘤细胞中的IC50值。利用克隆形成,Transwell侵袭实验检测奥西替尼对胶质瘤细胞的抑制作用。利用Western Blot检测TRIP13对副凋亡蛋白表达的影响。3、研究结果（1）TRIP13在高级别胶质瘤中高表达TRIP13在临床高级别胶质瘤（Ⅲ,Ⅳ级）样品中高表达,低级别胶质瘤（Ⅰ,Ⅱ级）样品中低表达。GSE4271＿U132A数据库分析结果显示TRIP13的表达与胶质瘤生存率呈负相关。TRIP13在非小细胞肺癌,结肠癌细胞中定位在细胞核,但在胶质瘤细胞中主要定位在细胞质。（2）TRIP13促进胶质瘤细胞增殖,侵袭,微球体形成敲低TRIP13抑制胶质瘤细胞的克隆形成和侵袭能力。过表达TRIP13促进胶质瘤细胞微球体形成,胶质瘤干性标记蛋白Nestin,SOX2表达增多。TRIP13促进胶质瘤细胞增殖,侵袭,微球体形成与TRIP13激酶活性不相关。（3）TRIP13促进EGFR通路活化3D培养胶质瘤细胞或EGF刺激条件下,过表达TRIP13与对照组比较,EGFR及其下游通路蛋白P-AKT（S473）,P-ERK1/2表达增多。TRIP13促进EGFR通路活化与TRIP13激酶活性不相关。（4）TRIP13与EGFR,EGFRVIII有相互作用293T细胞中外源过表达Flag-TRIP13,GFP-EGFR,myc-EGFRVIII,免疫共沉淀结果显示TRIP13与EGFR,EGFRVIII均有相互作用,该相互作用与TRIP13激酶活性不相关,与EGFR激酶活性呈正相关。此外,U87MG,LN-229细胞中内源EGFR与TRIP13也有相互作用,并且EGF刺激条件下相互作用增强。（5）EGFR调控TRIP13 Y56磷酸化活化的EGFR与EGFRVIII均能通过56位酪氨酸磷酸化TRIP13。过表达TRIP13-Y56F突变体不能促进胶质瘤细胞侵袭和微球体形成。（6）TRIP13促进趋化因子CXCL6分泌转录组测序结果显示,敲低TRIP13显著下调趋化因子通路,趋化因子CXCL6下调最显著。过表达TRIP13细胞上清中CXCL6表达增多,TRIP13通过EGFR调控CXCL6表达。CXCL6能够促进胶质瘤细胞侵袭,但是对胶质瘤细胞增殖能力没有影响。（7）敲低TRIP13增强胶质瘤细胞对奥西替尼的敏感性奥西替尼能够抑制胶质瘤细胞增殖,侵袭,微球体形成。奥西替尼抑制EGFR通路活化,促进副凋亡蛋白CHOP表达,减弱抗凋亡蛋白Bcl-2表达。过表达TRIP13能够减少奥西替尼诱导的胶质瘤细胞死亡,下调CHOP蛋白的表达。4、研究结论（1）TRIP13高表达降低胶质瘤患者生存率（2）TRIP13促进胶质瘤细胞增殖,侵袭和微球体形成（3）EGF刺激条件下TRIP13促进EGFR通路活化（4）EGFR,EGFRVIII调控TRIP13 Y56磷酸化（5）敲低TRIP13抑制趋化因子CXCL6分泌（6）敲低TRIP13增强胶质瘤细胞对奥西替尼的敏感性