柠檬酸是一种重要的多功能有机酸,广泛应用于食品、医药、化工等领域。我国是柠檬酸生产大国,柠檬酸产量占世界总产量的70%。但在柠檬酸发酵生产过程中,发酵液残糖含量2%左右,造成原料的极大浪费。分析发酵液残糖成分可知,其中约69%都是异麦芽糖,还有约23%为α-呋喃型葡萄糖苷,而这些非发酵性的糖主要是由α-葡萄糖苷酶的催化形成的。因此,柠檬酸发酵过程中决定残糖形成的关键酶之一是α-葡萄糖苷酶。本研究通过分析产柠檬酸黑曲霉基因组序列,分析其中可能的α-葡萄糖苷酶基因并进行基因敲除,降低残糖含量,提高糖类的利用率和柠檬酸的产量。具体展开以下研究工作:1.运用农杆菌介导的方法转化产柠檬酸黑曲霉,分别敲除了α-葡萄糖苷酶A基因及假定-α-葡萄糖苷酶基因-40261,得到敲除突变株KO-214233及KO-40261。2.研究两个基因敲除菌株的生长状态发现,两株敲除菌株与野生型菌株相比菌落形态、孢子形态和菌体生长速度无明显变化,但菌丝球形态与大小发生改变。敲除突变株KO-214233相比敲除突变株KO-40261及野生型菌株的菌丝球边缘更为光滑;敲除突变株KO-214233菌丝球周长最小,敲除突变株KO-40261次之,野生型菌株菌丝球周长最大。3.发酵后检测敲除菌株与野生型菌株总糖、还原糖、异麦芽糖及柠檬酸含量。结果显示,敲除突变株KO-214233和KO-40261发酵液中总糖含量分别降低了 10.11%和3.03%、还原糖含量分别降低了 9.44%和3.93%、异麦芽糖含量分别降低了 19.98%和6.37%,柠檬酸产量分别提高了 9.54%和3.51%。这些结果表明:基因214233和基因40261敲除可以降低残糖的含量,提高糖类的利用率和柠檬酸的产量。该研究为利用黑曲霉生产柠檬酸和其他化学品时提高糖类的利用率和生产效率奠定了基础。