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目的:疫苗的使用已大幅降低乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的感染,但其仍然是全球严重的健康问题,受累人数超过3.5亿。现有的治疗手段存在疗程长、副作用大、病毒逃逸等问题,导致HBV感染者的治愈率低。目前对HBV缺乏有效的治疗手段主要因为对其生活周期缺乏了解。HBV进入肝细胞是整个生活周期的重要部分,对此过程及其机制的探讨可能对其新药研发提供新的思路。研究发现上皮细胞主要表达的钙黏素E-cadherin与病原体的感染存在相关性。本研究主要探讨E-cadherin对HBV感染肝细胞的影响及机制。方法:1、E-cadherin在HBV感染肝细胞中的作用1.1本研究所用的细胞模型、HBV颗粒和HBV假病毒本研究共用三种细胞模型:稳定表达NTCP的Hep G2-NTCP细胞、已分化为肝细胞的Hepa RG细胞及人肝原代细胞(primary human hepatocytes,PHH)。已知它们均可被HBV感染,均表达E-cadherin;通过检测、比较Hepa RG和Hep G2-NTCP细胞的E-cadherin表达水平,我们发现Hepa RG细胞的E-cadherin水平更低。因此,本研究首先通过下调三者的E-cadherin表达以探讨E-cadherin在HBV感染肝细胞过程中的作用,进而通过在Hepa RG细胞过表达E-cadherin来验证上述实验结果。本研究采用的HBV颗粒有两种来源:1)从Hepa AD38细胞上清中富集的HBV颗粒(eriched HBV,e HBV);2)慢乙肝病人血清中的HBV颗粒(s HBV)。本研究还合成了HBV假病毒(HBV pseudotyped particles,HBVpps),它可感染肝细胞,但是不能在肝细胞内复制。采用e HBV或s HBV感染肝细胞后,HBV相关标志物的检测指标和方法包括:q RT-PCR检测HBV 3.5kb m RNA、Western blot检测HBV core(HBc)、ELISA检测细胞上清中的HBs Ag以及细胞免疫荧光技术检测细胞内HBs Ag。1.2下调E-cadherin对e HBV和s HBV感染肝细胞的影响1)通过对前述三种肝细胞转染si RNA-E-cadherin,探讨E-cadherin在HBV感染肝细胞的过程中的作用。2)实验共分为四个组:阴性对照组,下调E-cadherin组,下调NTCP组,同时下调E-cadherin和NTCP组。3)在肝细胞中转染si RNA后3d:(1)加入e HBV,2d后检测HBV 3.5kb m RNA;3d后检测HBc和细胞内HBs Ag,并根据表达荧光的细胞数采用Image J-win 64计算细胞的病毒感染率;4d后检测细胞上清中的HBs Ag;(2)加入s HBV,4d后采用上述方法检测HBV相关标志物。1.3过表达E-cadherin对e HBV感染肝细胞的影响1)实验对象:低表达E-cadherin的Hepa RG细胞。2)实验分为2组:阴性对照组和过表达E-cadherin组。3)转染质粒后3d,加入e HBV,2d后检测HBV 3.5kb m RNA,3d后检测HBc和细胞内HBs Ag。1.4下调E-cadherin对HBVpps感染肝细胞的影响1)研究对象:Hep G2-NTCP和Hepa RG细胞。2)实验分组:同1.2。3)在转染si RNA 3d后,加入合成的HBVpps,72h时检测HBVpps表达的双荧光素酶。2、E-cadherin影响HBV感染肝细胞的机制研究2.1下调E-cadherin对HBV pre S1与肝细胞受体NTCP的结合及其进入肝细胞的影响1)研究对象:Hep G2-NTCP和PHH细胞。2)实验分为四组:阴性对照组、下调E-cadherin组、下调NTCP组和同时下调E-cadherin和NTCP组。3)转染si RNAs 3d后,加入采用DMEM稀释至终浓度为0.1μg/μl的pre S1多肽(Myr-2-47aa-FITC),4℃(pre S1只可结合到肝细胞膜上的受体)或37℃(pre S1可进入肝细胞)孵育2h,再观察肝细胞膜上和细胞内的pre S1多肽表达的绿色荧光。2.2 E-cadherin对NTCP水平和分布的影响1)对NTCP表达水平的影响(1)通过RNA干扰下调Hepa RG或Hep G2-NTCP细胞中的E-cadherin后,观测NTCP表达水平和稳定性的变化。(2)实验分组及实验程序:阴性对照组和下调E-cadherin组。将si RNA转染Hepa RG或Hep G2-NTCP细胞3d后,提取细胞总蛋白,采用Western blot检测其中NTCP的水平。2)研究E-cadherin对NTCP分布的影响(1)Hep G2-NTCP细胞:分为阴性对照和下调E-cadherin两个组。转染si RNA后3d,采用细胞免疫荧光技术检测NTCP;同时,提取膜蛋白,再采用Western blot检测膜上NTCP的表达量。(2)Hepa RG细胞:分为阴性对照组和过表达E-cadherin组。转染质粒后3d,提取膜蛋白,并用Western blot检测膜上NTCP的表达量。2.3 E-cadherin影响NTCP亚细胞分布的机制1)采用Co-IP研究在Hep G2-NTCP细胞中E-cadherin和NTCP是否存在相互作用。2)研究与E-cadherin结合的NTCP以及细胞膜上的NTCP是否发生糖基化:用Western blot检测NTCP,观察、比较NTCP分子量的变化,以确定NTCP糖基化的存在。检测对象包括:(1)经PNGase F酶切或未酶切的上述Co-IP产物和(2)经PNGase F酶切或未酶切的Hep G2-NTCP细胞膜蛋白。3)探讨NTCP的糖基化在其与pre S1结合中的作用:将合成的pre S1多肽(Myr-2-47aa-Biotin)结合到磁珠上,再与Hep G2-NTCP细胞裂解液孵育,行Pull-down试验,用Western blot检测NTCP,根据其条带位置判定其是否发生糖基化。结果:1、E-cadherin协助HBV感染肝细胞1.1下调E-cadherin可抑制e HBV感染肝细胞我们的实验发现:1)三个实验组的HBV 3.5kb m RNA水平明显低于对照组(P<0.01);2)三个实验组的HBc表达水平均低于对照组(P<0.05),三个实验组间差异无统计学意义;3)三个实验组细胞的病毒感染率也低于对照组(P<0.05),其中同时降低E-cadherin和NTCP组细胞的病毒感染率最低;4)实验组上清中的HBs Ag水平低于对照组(P<0.05),三个实验组间差异无统计学意义。这组实验结果提示E-cadherin具有促进HBV感染肝细胞的作用。1.2下调E-cadherin抑制s HBV感染肝细胞三个实验组的HBV 3.5kb m RNA水平均明显低于对照组(P<0.01);三个实验组的HBc和细胞病毒感染率也均低于对照组(P<0.01),且三个实验组间差异无统计学意义。这组实验结果与1.1一致,进一步提示E-cadherin具有促进HBV感染肝细胞的作用。1.3过表达E-cadherin促进e HBV感染肝细胞实验组的HBV 3.5kb m RNA水平高于对照组(P<0.001),且呈剂量依赖性;实验组的HBc和细胞病毒感染率均高于对照组(P<0.01)。这组实验结果与1.1和1.2一致,进一步证明E-cadherin具有促进HBV感染肝细胞,并呈剂量依赖性。1.4下调E-cadherin可抑制HBVpps感染肝细胞实验组HBVpps表达的双荧光素酶低于对照组(P<0.01),三个实验组间差异无统计学意义。证明E-cadherin具有促进HBVpps感染肝细胞的作用。综上,本部分实验通过分别下调或上调肝细胞中E-cadherin的表达后,采用e HBV、s HBV和HBVpps感染肝细胞,再检测肝细胞中HBV相关标志物或双荧光素酶,全部实验结果一致证明E-cadherin有助于HBV感染肝细胞。2、E-cadherin影响肝细胞上HBV的受体NTCP的亚细胞分布2.1下调E-cadherin可抑制pre S1结合到肝细胞膜上及进入细胞内观察pre S1在细胞膜或细胞浆表达的绿色荧光,发现:1)三个实验组结合到肝细胞膜上的pre S1多肽量均低于对照组;2)三个实验组进入到细胞内的pre S1多肽也均低于对照组。提示E-cadherin具有促进pre S1结合到肝细胞膜上及进入细胞内的作用。2.2 E-cadherin可影响NTCP的亚细胞分布1)下调E-cadherin的Hepa RG和Hep G2-NTCP细胞中的NTCP表达量与对照组无明显差异。提示E-cadherin对NTCP的表达和稳定性无明显影响。2)在Hep G2-NTCP细胞中阴性对照组的NTCP主要分布于细胞膜上,而下调E-cadherin组的NTCP主要分布于细胞浆内。3)膜蛋白的Western blot检测结果:下调E-cadherin组的细胞膜上NTCP表达量低于对照组(P<0.05),而过表达E-cadherin组的细胞膜上NTCP表达量高于对照组(P<0.05)。这组实验结果提示E-cadherin可影响NTCP的亚细胞分布,它促进NTCP从胞浆募集到胞膜。2.3 E-cadherin在细胞内与糖基化NTCP结合1)采用抗-E-cadherin抗体进行Co-IP实验,Western blot检测到NTCP条带,其分子量约为50k Da,大于未糖基化的NTCP(分子量为39k Da);同时采用抗-NTCP抗体进行Co-IP实验,Western blot检测到E-cadherin。提示细胞内E-cadherin可与NTCP结合,且结合的是糖基化的NTCP。2)Western blot分别检测上述Co-IP产物和Hep G2-NTCP细胞膜蛋白的PNGase F酶切产物中的NTCP:酶切组的50k Da处的NTCP量较未酶切组降低,并且同时在39k Da处增加了一个条带。这个结果进一步提示与E-cadherin结合并因此分布于细胞膜上的NTCP是已糖基化的NTCP。3)用结合有pre S1的磁珠与Hep G2-NTCP细胞裂解液孵育,进行Pull-down实验,Western blot检测到两条NTCP条带,分子量约为50k Da和60k Da,而39k Da处未见条带。提示pre S1与糖基化的NTCP结合,NTCP的糖基化可能是其与pre S1结合所必需的。本部分实验发现E-cadherin有助于pre S1结合到肝细胞膜上及进入肝细胞,并且其机制是E-cadherin通过与糖基化的NTCP结合,从胞浆中募集糖基化的NTCP到肝细胞膜上,从而有利于pre S1与肝细胞膜上的受体即糖基化的NTCP相结合。结论:1.E-cadherin有助于HBV感染肝细胞。2.E-cadherin促进HBV的pre S1与肝细胞膜的结合和进入细胞。3.E-cadherin对HBV在肝细胞上的受体NTCP的表达水平和稳定性无明显影响,主要影响其亚细胞分布,即促其从胞浆到胞膜。4.E-cadherin通过与糖基化的NTCP结合并以此募集胞浆中的NTCP到细胞膜上,有利于HBV的pre S1与其受体NTCP的结合,从而有助于HBV的感染和入胞。