前言支气管哮喘(Asthma)是一种以肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞气道浸润,以黏液高分泌、气道高反应性和气道重构为特征的慢性气道炎症性疾病。关于气道炎症的发生,以往的研究普遍认为主要是免疫源性炎症,其具体机制尚有待进一步的研究。多数学者认为辅助性T淋巴细胞两种亚型(Thl细胞和Th2细胞)的失衡是哮喘发生的重要机制,具体则表现为Th2细胞的活化亢进,这是哮喘发病机制中的关键环节。Th1、Th2细胞是由共同的前体细胞,即Th0细胞分化而来,转录因子GATA3是Th2细胞特异性的转录因子,IFN-γ和IL-4则分别是Thl和Th2类细胞因子的主要代表。蛋白质是生物体内一切功能的执行者,故研究疾病必须依赖于分析最终的功能蛋白。所以研究哮喘发病的功能蛋白对揭示哮喘的发病机制有着不可替代的作用。近年来一种蛋白逐渐进入国外诸多科学家的视野,并被视为哮喘极具前景的治疗靶点—β-arrestin-2。β-arrestin-2是一种细胞内的信号调节蛋白,广泛参与G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors,GPCRs)相关信号通路。近年国外多项研究发现β-arrestin-2在哮喘发病中发挥正向调节作用。β-arrestin-2基因敲除小鼠可能通过抑制T细胞向肺脏的趋化,抑制哮喘气道T细胞的募集以及气道炎症和气道高反应性的产生；肺脏基质细胞表达的β-arrestin-2基因对于哮喘气道高反应性的形成必不可少；此外,造血干细胞来源的β-arrestin-2促进哮喘气道炎症的形成和嗜酸性粒细胞的因子的趋化。因此,β-arrestin-2是调节哮喘发病的一个重要因子。以Th2活化亢进为特征的Th1/Th2失衡是哮喘发病的关键。那么,β-arrestin-2是否也可以影响T细胞细胞因子的分泌?β-arrestin-2是一种GPCR调节蛋白,多是通过调节GPCR发挥作用。T细胞表面表达一定量的β2肾上腺素受体(β2-adrenergic receptor, β2AR),β2AR是GPCR的家族成员之一。研究发现T细胞表面的p2AR调节哮喘患者T细胞细胞因子的分泌和趋化。而β-arrestin-2可以多途径调控β2AR介导的信号传导。因此,我们设想β-arrestin-2可能通过调节p2AR间接影响哮喘小鼠Th1/Th2细胞型的细胞因子分泌。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是高度保守的基因沉默技术,它在功能上与基因敲除或基因沉默一致,但比基因敲除技术更为方便快捷。在本研究中,我们利用RNA干扰技术下调急性哮喘小鼠脾CD4+T细胞的β-arrestin-2的表达,以Th1、Th2细胞特征性的细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-5为评估的靶点,以急性哮喘小鼠脾CD4+T细胞表面的β2AR为桥梁,探讨急性哮喘小鼠模型脾CD4+T细胞中β-arrestin-2对IFN-γ、IL-4和IL-5的影响以及β2AR在此过程中发挥的作用。研究的主要目的之一是探讨β-arrestin-2对急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞分泌IFN-γ、IL-4和IL-5的影响；研究的主要目的之二是探讨β-arrestin-2对急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞表面β2AR的表达变化的调节以及β2AR在β-arrestin-2对脾源性CD4+T细胞分泌IFN-γ、IL-4和IL-5的影响中发挥的作用。通过此项研究,我们希望进一步发现β-arrestin-2在哮喘T细胞免疫中的作用及可能机制,以期为哮喘防治提供新思路和理论依据。第一章急性哮喘小鼠模型的建立与评价目的建立急性哮喘小鼠模型,并鉴定建立的急性哮喘小鼠模型是否成功。方法将28只SPF级BABL/c雌性小鼠随机分为两组：急性哮喘组(20只)以OVA致敏、激发；正常对照组(8只)以等体积的PBS代替OVA致敏、激发；两组均在末次激发24h后处理小鼠。处理包括：(1)查看小鼠的一般行为活动；(2)乙酰甲胆碱激发小鼠后,有创肺阻抗法测定小鼠的气道阻力(RL)和肺动态顺应性(Cdyn);(3)观察肺组织的病理变化；(4)BALF行细胞学分类、计数；(5)计算脾源性CD4+T细胞总数；(6)测定BALF和脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-4的浓度。结果(1)急性哮喘组小鼠出现类似于人的哮喘发作症状,而正常对照组小鼠表现基本正常；(2)与正常对照组相比,急性哮喘组小鼠RL对乙酰甲胆碱的浓度反应曲线明显上移(P<0.01)；急性哮喘组小鼠Cdyn对乙酰甲胆碱的浓度反应曲线明显下移(P<0.01)；(3)与正常对照组相比,急性哮喘组小鼠肺组织支气管及血管周围大量炎性细胞浸润(P<0.01),气道上皮可见分泌较多黏液；(4)急性哮喘组小鼠BALF细胞总数及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数明显高于正常对照组(P均<0.01)；(5)急性哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞总数明显高于正常对照组(P均<0.01)；(6)与正常对照组相比,急性哮喘组小鼠BALF和脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-4的浓度明显增高(P均<0.01)。结论(1)建立了急性哮喘小鼠动物模型,并且模型鉴定成功。第二章β-arrestin-2对急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞Th1/Th2型细胞因子的影响目的探讨急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞β-arrestin-2表达的变化以及β-arrestin-2对急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞Th1/Th2型细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-5)分泌的影响及其与GATA3的关系。方法(1)研磨小鼠脾脏制成单个核细胞悬液后裂解红细胞,再予免疫磁珠分离小鼠脾源性CD4+T细胞,悬于加有胎牛血清的RPMI-1640培养液；(2)首先应用Real-time PCR和Western blot检测β-arrestin-2mRNA和蛋白的表达；(3)通过基因瞬时转染的方法,将三对β-arrestin-2siRNA (siRNA-ARRB2)片段和阴性对照片段分别转染入急性哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞后,进行RT-PCR检测β-arrestin-2的表达,筛选出其中具有最佳沉默效果的片段；(4)Western blot检测阴性对照组、转染最佳siRNA组哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中β-arrestin-2的蛋白的表达；(5)将筛选片段转染入急性哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞,ConA和PMA刺激培养24小时后,行ELISA检测CD4+T细胞培养上清中IFN-γ、IL-4和IL-5的浓度；(6)Real-time PCR和Western blot检测GATA3mRNA和蛋白的表达。结果(1)急性哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞β-arrestin-2mRNA和蛋白的表达明显高于正常对照组(P均<0.01)；(2)在三对siRNA片段中以siRNA-ARRB2-1123沉默效果最为明显(P<0.01)；(3)转染siRNA-ARRB2哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中GATA3蛋白和]mRNA的表达明显低于未转染siRNA哮喘小鼠(P均<0.01)；(4)转染siRNA-ARRB2急性哮喘小鼠的脾源性CD4+T细胞中IFN-γ、IL-4和IL-5与未转染siRNA组哮喘小鼠相比较均无显著差异。结论(1)β-arrestin-2不直接影响急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中IFN-γ、IL-4和IL-5的分泌；(2)β-arrestin-2促进急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中GATA3的表达,但不影响IFN-γ、IL-4和IL-5的分泌。第三章β-arrestin-2通过β2AR对急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞Th1/Th2型细胞因子的分泌的影响目的探讨β-arrestin-2是否通过p2AR影响急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞Th1/Th2型细胞因子的分泌?是否与GATA3相关?方法将最佳siRNA-ARRB2-1123片段转染入急性哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞。(1)流式分析检测正常小鼠、哮喘小鼠和哮喘siRNA-ARRB2转染小鼠CD4+T细胞表面β2AR的表达；(2)哮喘未转染组和哮喘转染组小鼠脾源性CD4+T细胞,悬于加有胎牛血清的RPMI-1640培养液,加入ConA和PMA刺激培养24小时,最后1小时加入特布他林刺激后行流式分析测定小鼠脾源性CD4+T细胞表面p2AR的表达；(3)ConA、PMA和特布他林刺激培养24小时后ELISA法检测哮喘未转染组和哮喘转染组脾源性CD4+T细胞培养上清中IFN-γ,、IL-4和IL-5的浓度；(4)Western blot和Real-time PCR检测GATA3的表达。结果(1)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞表面表达的β2AR较正常组显著较低(P<0.01)；(2)转染siRNA-ARRB2后,急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞β2AR的表达无明显变化；(3)特布他林刺激后：1)特布他林刺激后,急性哮喘小鼠的脾源性CD4+T细胞表面的p2AR表达明显下降(P<0.05)；急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞的IFN-γ的浓度明显下降(P<0.05)；IL-4、IL-5、GATA3表达无明显变化；2)特布他林刺激后,转染siRNA-ARRB2的哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞表面的β2AR的表达明显高于未转染siRNA哮喘小鼠(P<0.01)；转染siRNA-ARRB2急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞的IL-4、IL-5的浓度明显低于未转染siRNA组哮喘小鼠(P均<0.05)；转染siRNA-ARRB2急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞GATA3蛋白的表达明显低于未转染siRNA组哮喘小鼠(P<0.01)；特布他林刺激后,转染siRNA-ARRB2急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞GATA3mRNA的表达明显低于未转染siRNA组哮喘小鼠(P<0.01)。结论(1)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞存在β2AR功能缺陷；(2)β-arrestin-2不影响哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞表面的β2AR的表达；(3)β-arrestin-2促进β2AR激动剂诱导的哮喘小鼠模型的脾源性CD4+T细胞表面的p2AR的下调；(4)β-arrestin-2可能通过β2AR促进急性哮喘小鼠脾源性Th2细胞型细胞因子的分泌；(5)β-arrestin-2可能通过GATA3促进急性哮喘小鼠脾源性Th2细胞型细胞因子的分泌的作用依赖β2AR。