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第一部分:大鼠肝移植的技术改进和急排模型的建立目的:对经典“二袖套法”进行技术改进,建立稳定的大鼠原位肝移植动物模型,观察DA—Lewis大鼠同种异体急性排斥反应的发生发展以及基本病理生理指标变化过程,为进一步研究凋亡脾淋巴细胞诱导移植免疫耐受建立良好的技术平台。方法:前期实验阶段采用改进的“二袖套法”,通过建立封闭群SD—SD大鼠原位肝移植模型150例,熟练建立大鼠肝移植模型的技能,提高稳定性。近交系大鼠正式实验分两组:A.同基因组(isogene group):Lewis—Lewis间18例;B.异基因组(allogene group):DA—Lewis间18例。除观察手术主要步骤用时、术后一般情况及术后存活时间外,受体分别于术后3d,5d,7d和10d处死取标本,观察肝脏组织病理变化,全自动生化分析法测定天冬氨酸转氨酶(AST)和总胆红素(TBil)水平变化。结果:前期实验阶段共进行大鼠原位肝移植实验150次,第二阶段能稳定建立起原位肝移植模型,供体手术时间:27.9±1.3min;修整供肝时间:12.0±1.1min:受体手术时间:55.4±2.3min:受体无肝期时间:17.9±0.9min;1周存活率93.3%(28/30)。同基因组大鼠无急性排斥表现(Williams标准),中位生存时间超过100天;肝组织发生轻度形态学改变,表现为肝细胞轻度变性浊肿,肝血窦轻度扩张,汇管区少量炎细胞浸润,整个肝小叶结构基本正常。异基因组大鼠术后黄疸明显,体重持续下降,中位生存时间为11天,术后第7天肝组织病理改变出现典型急排反应(Williams标准),表现为肝细胞变性重,有较多坏死细胞,肝血窦显著扩张充血,汇管区大量炎性细胞浸润,肝小叶结构破坏。肝功能方面,术后3d两组AST无显著性差异(P=0.741),同基因组TBil比异基因组高(P=0.004),5d、7d、10d异基因组AST、TBil水平均明显高于同基因组(P≤0.001)。结论:采用改进的“二袖套法”建立大鼠原位肝移植模型手术成功率高,稳定性好。综合异基因组大鼠术后在一般情况、生存时间、肝组织病理、血清肝功能等方面的表现,与临床急性排斥反应的特点相似,可证明DA—Lewis品系组合为肝移植急性排斥组合,尤其第7天开始出现典型排斥反应(Williams标准),可作为反应排斥程度的检测指标的时间点。同时,此急排模型可作为第二阶段凋亡细胞诱导移植免疫耐受研究良好的技术平台。第二部分供者凋亡淋巴细胞对大鼠肝移植急排模型细胞因子的影响目的:已知凋亡细胞发生免疫调节作用时伴有细胞因子等微环境的变化,本章实验在建立大鼠肝移植急性排斥模型的基础上,了解预输注凋亡脾淋巴细胞对排斥反应的抑制效果,并通过观察受体移植后肝组织内和外周血中细胞因子的变化,初步探讨凋亡细胞诱导免疫耐受的机制。方法:通过56℃水浴30分钟制备供体坏死脾淋巴细胞,通过直线加速器照射2.0 Gy培养8h制备供体凋亡脾淋巴细胞,并以AnnexinV联合PI双标法流式细胞仪检测两组细胞的凋亡率。按第一章方法建立DA—Lewis大鼠肝移植模型。实验分三组:1.对照组(Control group,CO):术前不做任何处理;2.坏死细胞组(Necrosis group,NE):术前第7天阴茎背静脉注射供体坏死脾淋巴细胞;3.凋亡细胞组(Apoptosis group,AP):术前第7天阴茎背静脉注射供体凋亡脾淋巴细胞。检测指标包括:1.术后存活时间的观察:每组4只,以100天为观察时间期限;2.肝功能检查、肝组织病理:每组分别于术后第7天处死大鼠(每组各处死3只),抽取外周血离心取血清于自动分析仪检测AST、TBil水平,切取肝组织行病理学检查。3.肝组织和外周血细胞因子检测:每组分别于术后第3、7、10天处死大鼠(每组每时间点各处死3只),取肝组织和外周血,低温环境下裂解组织和离心提取样本,以Luminex液相芯片法检测细胞因子,指标包括IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ。结果:1.流式细胞仪检测脾淋巴细胞结果:56℃水浴30分钟水浴制得细胞坏死率达98.561%,直线加速器照射2.0 Gy培养8h制得细胞凋亡率达50.408%。2.术后存活时间:三组生存时间有显著性差异(F=110.667,P=0.000)对照组中位生存时间11天,坏死细胞组10天,两者间无显著性差异(P=0.878),凋亡细胞术后存活时间延长(P=0.000),中位生存时间超过100天。3.肝功能检测:坏死细胞组AST、TBil均高于对照组(P=0.010,0.024),而凋亡细胞AST、TBil均低于对照组(P=0.000)。4.肝组织病理学:移植术后第7天,对照组和坏死细胞组均呈重度排斥反应(Williams3级),表现为表现为肝细胞变性重,有较多坏死细胞,肝血窦显著扩张充血,汇管区大量炎性细胞浸润,肝小叶结构破坏。凋亡细胞组凋亡细胞组呈轻度排斥反应(Williamsl级)。肝细胞索状排列基本整齐,小叶结构清晰,肝细胞轻度浊肿,有点状坏死;汇管区少量炎性细胞浸润,血管轻度扩张充血。5.肝组织细胞因子变化:在各时间点(术后第3、7、10天)上,三组间大鼠肝组织内IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平均有显著性差异(P＜0.01)。其中,各时间点坏死细胞组IL-2、IFN-γ水平均比对照组高(P＜0.05),而凋亡细胞组则比对照组低(P＜0.05):除了于术后第3天,凋亡细胞组与对照组间IL-10水平无显著性差异外,其他各时间点坏死细胞组IL-4、IL-10水平均比对照组低(P＜0.05),而凋亡细胞组则比对照组高(P＜0.05)。6.外周血细胞因子变化:对照组和坏死细胞组的术后血清IL—4、IL—10变化不大,三个时间点间无显著性差异(P＞0.05),在术后三时间点(术后第3、7、10天),两组间的IL—4、IL—10水平也均无统计学意义(P＞0.05),而两者的IL—2、IFN—γ水平则有显著性差异,坏死细胞组偏高(P＜0.05)。而对于凋亡细胞组,除了术后第3天IL—4水平与前两者无统计学意义外(P＞0.05),在各个时间点上,其IL—2、IFN—γ均比对应的坏死细胞组和对照组低(P＜0.05),而IL—4、IL—10水平则比后两者均高(P＜0.05)。结论:1.直线加速器X线照射2.0Gy和培养8小时能够简便有效地诱导大鼠脾细胞凋亡,凋亡率高,重复性强。2.从术后第7天的肝组织病理检查和血清肝功能结果显示术前7天预输注供体凋亡脾淋巴细胞能明显、确切减轻受体对同种异基因移植物的排斥反应,而坏死细胞则起相反效果,术后存活时间的结果更提示凋亡细胞可能诱导同种异基因肝移植受体的长期存活。3.从术后3、7、10天肝组织内和外周血中细胞因子检查结果所示,凋亡脾淋巴细胞的预输注可使移植后Th2细胞因子(IL-4、IL-10)的水平上调及抑制Th1(IL-2、IFN-γ)的表达,说明凋亡细胞诱导移植免疫耐受可能与调节Th1/Th2平衡有关,即促使Th0细胞往Th2细胞分化而抑制Th1细胞生成的趋势。4.由于Th1/Th2模式的局限性,此四种细胞因子变化如何对耐受诱导产生影响,还需要进一步对肝组织中其他细胞类型和反应功能的改变,如调节T淋巴细胞、记忆T细胞、B细胞等进行相继的研究。