背景及目的骨关节炎的病理改变通常表现为关节软骨的不规则缺损。由于关节软骨中缺乏血管和神经,一旦损伤后,人体自身对其修复能力极其有限,组织工程再生医学的出现和发展为我们带来了修复病损关节软骨的希望。本研究旨在评价从使用Kartogenin预处理过后的髌下脂肪垫间充质干细胞中提取的外泌体的作用,明确其促进软骨缺损修复的能力及可行性,并探究在该外泌体中发挥主要作用的内容物性质及相关机制。方法及结果第一部分:Kartogenin预处理对髌下脂肪垫间充质干细胞外泌体促进软骨细胞成软骨能力的作用研究研究方法:(1)从兔髌下脂肪垫中提取分离髌下脂肪垫间充质干细胞,并进行传代培养;(2)使用流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志物CD34、CD45、CD73、CD90、和CD105等,并对间充质干细胞进行成骨、成脂、成软骨三系诱导分化,鉴定其多向分化潜能;(3)使用Kartogenin预处理间充质干细胞,收集预处理后及未处理的两种间充质干细胞培养过程中的上清液,使用超速离心法收集两种干细胞所分泌的外泌体;(4)使用Western blot检测两种外泌体中特异性表面蛋白表达情况,使用BCA法检测所提取外泌体的蛋白浓度,使用Nanosight检测外泌体浓度及纯度,使用透射电镜检测外泌体形态;(5)从兔膝关节软骨中提取软骨细胞,并进行传代培养及鉴定;(6)在软骨细胞中加入外泌体培养,检测外泌体对于软骨细胞增殖能力的影响;(7)在软骨细胞中加入外泌体培养,使用Western blot及qRT-PCR检测成软骨特异性蛋白及基因的表达变化情况。实验结果:(1)成功分离提取到了兔髌下脂肪垫间充质干细胞;(2)流式细仪检测间充质干细胞表面标志物CD34、CD45、CD73、CD90和CD105等,明确了干细胞提取质量,三系诱导分化实验证明了所提取的间充质干细胞具有多向分化潜能;(3)使用超速离心法提取到了两种外泌体exo及KGN-exo,Western blot检测其外泌体特异性表面蛋白CD9和TSG101表达阳性,透射电镜下观察到扁平盘状双凹面的特征性外泌体结构,Nanosight检测显示沉淀物粒径集中于40-100nm之间,提示所提取外泌体纯度较高;(4)成功分离提取到了兔软骨细胞,加入外泌体处理后,结果显示exo和KGN-exo均可显著促进软骨细胞增殖能力增强;(5)使用exo及KGN-exo分别处理软骨细胞后,Western blot及qRTPCR检测结果显示,KGN-exo可促进成软骨特异性蛋白及基因表达。结论:我们成功分离提取了兔髌下脂肪垫间充质干细胞,通过鉴定其符合国际通用标准,并从干细胞培养的上清液中提取到了两种外泌体exo及KGN-exo,外泌体的鉴定也符合实验要求。在体外实验中,我们验证了使用KGN预处理间充质干细胞后可显著增强外泌体促进软骨细胞增殖和成软骨相关蛋白及基因表达的能力。第二部分:Kartogenin预处理对髌下脂肪垫间充质干细胞外泌体促进兔关节软骨损伤修复作用的研究研究方法:(1)使用手术方法在兔膝关节股骨滑车部制造软骨缺损动物模型;(2)使用4种不同方法处理实验动物:空白对照、髌下脂肪垫间充质干细胞注射、exo注射、KGN-exo注射;(3)术后4周和12周时分批处死实验动物,进行标本大体观察及评分,组织学染色及评分。实验结果:(1)兔膝关节软骨缺损造模成功;(2)术后4周和12周时分批处死实验动物,大体观察及评分结果显示,使用KGN-exo处理组,修复组织表面光滑平整,缺损部位几乎均被再生的软骨组织所覆盖,填充良好,修复组织内几乎无裂缝,与周围正常软骨组织接合良好,难以看到边界,明显优于其余三组,大体评分KGN-exo组也明显高于其余三组;(3)HE染色及番红固绿染色结果显示KGN-exo组缺损部位几乎被完全修复,表明平整,可见大量透明软骨样结构,未见明显裂缝,番红O染色见均匀强阳性染色,提示其内含有大量蛋白多糖,修复组织与周围正常软骨完全整合,难以看到边界。组织学评分KGN-exo组也明显高于其余三组。结论:我们成功制造了兔膝关节软骨缺损模型,采用4种不同方法处理后,在4周及12周时分批处死实验动物,大体观察及评分、组织学染色及评分结果表明,KGN处理髌下脂肪垫间充质干细胞后所提取的外泌体具有最强促进软骨缺损修复的能力,其明显优于其余三组。第三部分:Kartogenin预处理对髌下脂肪垫间充质干细胞外泌体促进软骨修复作用的机制探索研究方法:(1)使用蛋白酶及核酸酶分别单独裂解KGN-exo中的蛋白和核酸,得到KGN-exo-RNAse和KGN-exo-PROnase;(2)分为4组进行蛋白和核酸裂解后外泌体促进软骨细胞表型改变的实验,使用Western blot及qRT-PCR检测外泌体处理后软骨细胞内Sox-9,Aggrecan,Col-II的蛋白及基因表达变化情况;(3)分为4组进行蛋白和核酸裂解后外泌体促进软骨细胞增殖能力改变的实验,使用CCK-8检测处理后软骨细胞增殖能力改变情况;(4)提取两种外泌体内的miRNA,通过高通量测序检测两种外泌体中miRNA表达差异情况;(5)检测在软骨细胞内分别加入两种外泌体处理后,相关miRNA表达情况;(6)验证过表达miR-140-5p、miR-127-5p、miR-125b的外泌体对成软骨作用的影响;(7)验证抑制miR-140-5p、miR-127-5p、miR-125b的外泌体对成软骨作用的影响。实验结果:(1)使用蛋白酶及核酸酶分别裂解了KGN-exo中的蛋白和核酸,得到仅存在蛋白的KGN-exo-RNAse和仅存在核酸的KGN-exoPROnase;(2)蛋白和核酸裂解后的外泌体促进软骨细胞表型改变的实验中,qRT-PCR结果显示KGN-exo-PROnase组成软骨特异性基因表达明显增高,与KGN-exo组比较无明显差异,明显高于KGN-exo-RNAse组,Western blot结果与qRT-PCR结果一致;(3)在各种外泌体促进软骨细胞增殖能力改变的研究中,KGN-exo-PROnase组软骨细胞增殖速度明显下降,显著低于KGN-exo-RNAse组;(4)使用miRNA试剂盒成功提取了两种外泌体exo和KGN-exo中的miRNA,通过高通量测序检测两种外泌体中miRNA表达情况,通过相互之间的比较,筛选出排名前三的表达差异在2倍以上的miRNA:miR-140-5p、miR-127-5p、miR-125b;(5)在软骨细胞内加入外泌体培养后,qRT-PCR结果提示,KGN-exo组miR-140-5p、miR-127-5p、miR-125b表达量均明显上升;(6)经过miRNA激动剂处理后,所提取的外泌体中miR-140-5p、miR-127-5p、miR-125b含量均明显提高,经ago-miR-140-5p-exo、ago-miR-127-5p-exo及ago-miR-125b-exo处理后,软骨细胞中成软骨相关基因Sox-9,Aggrecan,Col-II的表达明显增高,这其中ago-miR-140-5p-exo组表达增高尤为明显;(7)通过miRNA抑制剂处理后,KGN-exo中miR-140-5p、miR-127-5p、miR-125b的含量均明显降低,同时,与未经处理的KGN-exo组相比较,KGNexo中的miR-140-5p、miR-127-5p、miR-125b被抑制后再与软骨细胞共培养可明显降低成软骨相关基因Sox-9,Aggrecan,Col-II的表达,而这其中尤以ant-miR-140-5p-exo组最为显著。结论:我们使用蛋白酶及核酸酶分别单独处理KGN-exo后加入软骨细胞培养,结果提示间充质干细胞来源的外泌体促进软骨修复的作用主要依靠外泌体内的核酸成分,而在外泌体促进软骨细胞增殖方面,则主要依赖于其内的蛋白成分发挥作用。高通量测序检测了KGN-exo和exo中差异表达的miRNA,提示使用KGN预处理后导致外泌体促进软骨修复能力显著增强可能与这些miRNA相关。并通过过表达及抑制这些miRNA验证了其对软骨再生的作用。在后续研究工作中,我们拟对这些miRNA调控软骨缺损修复的具体机制开展进一步研究。小结1、KGN预处理的髌下脂肪垫间充质干细胞释放的外泌体可以显著增强外泌体在体外及体内促进软骨修复再生的能力。2、KGN预处理髌下脂肪垫间充质干细胞后所提取的外泌体促进成软骨分化的能力主要依赖于外泌体内的核酸成分发挥作用,而在促进软骨细胞增殖能力方面则主要依赖于外泌体内的蛋白成分。3、KGN预处理间充质干细胞后主要改变了外泌体内miR-140-5p、miR-127-5p、miR-125b的表达量,可能介导了其成软骨能力的增强。4、在后续研究工作中,我们拟对这些miRNA调控软骨缺损修复的具体机制开展进一步研究,深入探索相关miRNA发挥作用的靶点及具体通路。