第一部分孕激素膜受体mPRs在孕酮调控心肌细胞钙循环中的作用与机理研究研究背景心血管疾病是当今威胁女性健康和死亡的主要疾病,是导致中国女性死亡的主要原因之一。近年来研究显示,性激素在女性心血管疾病发生、发展以及预后中起着重要作用。尽管内源性雌激素的潜在心血管保护作用己被众多研究所证实,如舒张血管等,然而对于天然孕激素-孕酮（progesterone,P4）及其受体在心血管系统中作用的认识多基于一些雌激素相关联的研究。迄今为止,P4与心血管系统直接关联的研究甚少。有研究显示,P4对心血管系统具有潜在的保护作用,包括扩张血管,降低血压,保护心肌缺血再灌住损伤等。然而P4作用于心血管系统的具体机制尚还不清楚。因此,直接阐明P4对心血管系统的潜在影响及作用机制将有益于充分理解女性激素在心血管疾病发生及发展过程中的作用,同时有望为绝经期女性心血管疾病防治提供一定的理论依据。传统观点认为,P4通过与孕激素核受体（nuclear progesterone receptor,nPR）结合,募集相关转录因子与孕激素反应原件相结合启动靶细胞内基因转录,从而发挥其生物学效应。区别于这一经典的基因机制,近年来,P4的另一种作用途径“非基因组机制”引起了广泛关注,这一机制不依赖于基因转录或蛋白合成,而是通过激活膜表面信号转导途径实现。越来越多的证据显示,非基因组机制在P4介导的效应中扮演重要的角色。然而介导P4非基因组作用的受体及机制尚不完全清楚。孕激素膜受体（membrane progesterone receptors,mPRs）是近些年发现并确立的一类新型孕激素受体。越来越多的研究表明,mPRs广泛存在于包括人在内的许多脊椎动物中,且能独立介导P4的快速非基因组作用。研究显示,P4通过mPRs促进人类血管内皮细胞NO生成。然而mPRs在P4调节心脏生理功能中的作用目前尚不清楚。众所周知,心肌细胞钙循环的稳定是心脏发挥正常生理功能的基础。近期文献报道,慢性P4暴露能明显缩短兔子心肌细胞钙离子重吸收时程及衰减时间。提示P4对心肌细胞钙循环具有重要的调节作用。因此,深入研究mPRs在心肌细胞钙循环中的作用具有重要科学意义。目的本研究试图探索孕激素膜受体mPRs亚型在心脏组织中的表达情况,同时明确mPRs在心肌细胞中的定位。揭示mPRs在P4调控心肌细胞钙循环中的作用,同时深入探究可能的分子信号机制。方法本研究以成年雌性SD大鼠为研究对象:1.利用RT-PCR和Western blot检测雌性大鼠心脏组织mPRs mRNA和蛋白的表达水平;2.应用免疫荧光技术观察mPRs在雌性大鼠心肌细胞上的定位;3.以离体雌性大鼠心肌细胞为模型,分为以下各组:正常对照组,P4组,mPRs激动剂（Org-OD）组,P4+mPRs抑制剂（PTX）组,Org-OD+PTX组,以及其他干预组进行如下研究:（1）利用钙离子成像、共聚焦显微成像、膜片钳及ELISA等技术对各组心肌细胞的钙瞬变、肌浆网（sarcoplasmic reticulum,SR）钙火花和钙负荷、L型钙电流、以及环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）等指标进行检测与比较,探究mPRs在P4调控心肌细胞钙循环中的作用。（2）运用Western-blot技术对各组心肌细胞兰尼碱受体（ryanodine receptor,RyR）及受磷蛋白（phospholamban,PLN）磷酸位点、钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CAMKⅡ）、内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）以及Akt等的磷酸化水平进行检测,进一步揭示mPRs介导P4作用的分子信号机制。结果1.mPRs mRNA和蛋白在雌性大鼠心脏组织中的表达:以大鼠卵巢组织为阳性对照,雌性大鼠左心室心肌组织中mPRα、mPRβ及mPRγ的mRNA和蛋白均呈阳性表达。与左心室相比,左右心房的mPRs mRNA水平均显著增加。2.mPRs蛋白在雌性大鼠心肌细胞中的定位:各mPRs抗体孵育的心肌细胞膜上均可观察到明显的绿色荧光信号。加入特异性mPRs阻断多肽共孵育后心肌细胞膜原有的绿色荧光信号消失。提示三种mPRs亚型均定位于雌性大鼠心肌细胞膜。3.mPRs介导P4增加雌性大鼠心肌细胞钙瞬变水平:10 nM P4急性处理15min后不仅心肌细胞钙瞬变幅度显著增加,而且钙瞬变衰减时程明显缩短。这些P4效应均被非透膜性偶联牛血清蛋白孕酮（membrane-impermeable BSA conjugated progesterone,P4-BSA）和 mPRs 特异性激动剂 Org-OD 完全模拟。同时,P4与Org-OD的钙瞬变效应均被抑制性G蛋白（Gi）抑制剂PTX阻断,但不能被核受体（nPR）特异性拮抗剂RU486阻断。4.mPRs介导P4增加雌性大鼠心肌细胞SR钙负荷水平:与正常对照组相比,P4组和Org-OD组咖啡因诱导的钙瞬变峰值显著升高,而P4与Org-OD的这一效应均能被PTX阻断。各组心肌细胞咖啡因诱导的钙瞬变衰减时程比较无统计学意义。5.mPRs介导P4促进雌性大鼠心肌细胞SR钙释放:与正常对照组相比,P4组和Org-OD组心肌细胞的钙火花频率均显著增加。PTX预处理后,P4与Org-OD诱导的上述效应均消失。各组心肌细胞钙火花振幅比较无显著差异。6.P4暴不影响雌性大鼠心肌细胞的L型钙电流:与正常对照组比较,P4组心肌细胞L型钙电流强度无明显改变。7.mPRs介导P4增加雌性大鼠心肌细胞SR钙转运蛋白RyR和PLN磷酸位点的磷酸化水平:与正常对照组比较,P4组和Org-OD组CAMKⅡ位点RyR2814及PLN17的磷酸化水平均显著增加。而它们的PKA位点RyR2808及PLN16的磷酸化水平与正常对照组相比均无明显差异。P4与Org-OD诱导的CAMKⅡ磷酸位点的磷酸化效应均能被PTX阻断。进一步实验显示,RyR2814及PLN17的磷酸化水平均随着Org-OD暴露时间延长呈现先升高后回到基线水平改变,于暴露15min后达到峰值。8.P4和Org-OD对雌性大鼠心肌细胞内cAMP水平的影响:与正常对照组比较,P4组心肌细胞cAMP水平无统计差异。相反,Org-OD组心肌细胞cAMP水平显著降低,且这一效应被PTX有效阻断。9.P4诱导的雌性大鼠心肌细胞钙循环改变依赖于CAMKⅡ活化:相比正常对照组,P4和Org-OD引起的R2814及PLN17磷酸化增加均被CAMKⅡ抑制剂AIP明显抑制。同样,P4和Org-OD诱导的钙瞬变增强效应及钙火花频率增加均被AIP所逆转。10.IP3/IP3R信号通路不参与mPRs诱导的CAMKⅡ活化:P4诱导的RyR2814及PLN17磷酸化增加不能被IP3R特异性阻断剂Xestospongin C抑制。11.PI3K/Akt/eNOS信号通路参与mPRs介导的信号转导:eNOS抑制剂L-NAME及PI3K阻断剂Wortmannin均明显抑制P4与Org-OD诱导的心肌细胞RyR2814及PLN17磷酸化增加。进一步实验显示,P4与Org-OD均明显增加心肌细胞CAMKⅡ及eNOS的磷酸化水平,而二者诱导的CAMKⅡ磷酸化增加均被L-NAME和Wortmannin阻断。同时它们诱导的eNOS磷酸化增加均被Wortmannin阻断。此外,P4与Org-OD暴露后心肌细胞Akt磷酸化水平均明显增加,而二者诱导的这一效应均能被PTX阻断。12.PI3K/Akt/eNOS信号通路介导mPRs诱导的雌性大鼠心肌细胞钙循环改变:与正常对照组比较,Wortmannin与L-NAME不仅完全阻断P4及Org-OD诱导的心肌细胞钙瞬变幅度升高,而且明显抑制它们诱导的钙火花频率增加。结论1.首次证实mPRs三种亚型mPRα、mPRβ以及mPRγ均在雌性大鼠心脏组织中表达,且均定位于心肌细胞膜。2.首次报道mPRs参与介导P4对雌性大鼠心肌细胞钙循环的快速调节作用。3.P4通过mPRs激活下游PI3K/Akt/eNOS信号通路,诱导CAMKⅡ位点RyR2814和PLN17磷酸化,导致SR钙重吸收及钙释放增加,从而增强雌性大鼠心肌细胞的钙瞬变水平。第二部分孕酮对双酚A促雌性大鼠心律失常发生的影响及其机制探讨研究背景双酚A（bisphenol A,BPA）是一种典型的环境雌激素干扰化合物,主要用于制作聚碳酸酯、环氧树脂等高分子材料。近年来,由于BPA制品在人们日常生活中的广泛使用,其安全性引起了国内外专家学者们的高度关注。大量研究表明,BPA通过其雌激素干扰效应对机体产生多种毒性作用,包括大脑发育和行为异常,胎儿生长发育不良,以及生殖和免疫系统紊乱等。值得注意的是,越来越多的研究发现,BPA对心血管系统也具有毒性作用。我们最近的研究表明,BPA急性暴露具有促雌性大鼠心律失常发生作用。可见,BPA对心脏的潜在危害不容忽视。研究发现,内源性类固醇激素能影响外源性雌激素干扰物的生物学效应。在多种细胞类型/系统中的研究显示,内源性雌二醇能加强或减轻BPA诱导的效应。我们前期研究也发现,生理浓度雌二醇能增强BPA的促雌性大鼠心律失常发生作用。鉴于此,许多学者认为评估外源性雌激素干扰物对机体的真实生物效应应该置于机体内源性激素背景下进行研究。众所周知,P4能协同/拮抗雌激素的效应参与调节生殖系统许多重要过程。事实上,P4与内源性雌激素的相互作用也普遍存在于其他的生理系统包括心血管系统。然而,P4与外源性雌激素干扰物BPA的相互作用尚未见相关报道。是否P4能阻断BPA的心脏毒性特别是其促心律失常发生作用尚有待于进一步研究。目的我们前期研究发现,BPA急性暴露具有促雌性大鼠心律失常发生作用。本研究进一步探究P4对BPA致雌性大鼠心律失常作用的潜在影响及其可能机制。方法本研究以离体成年雌性大鼠心肌细胞为研究对象:1.利用视频边缘检测技术和共聚焦显微成像技术分别检测心肌细胞触发活动指标after-contraction和after-transient发生率,观察P4对BPA诱导的心肌细胞触发活动的影响。2.应用钙离子成像技术和共聚焦显微成像技术分别检测心肌细胞咖啡因诱导的钙瞬变和肌浆网（sarcoplasmic reticulum,SR）钙火花水平,同时通过Western blot技术检测SR钙转运蛋白RyR及PLN磷酸位点,以及Akt的磷酸化与总蛋白水平,探讨P4作用的可能机制。结果1.1 nMP4快速抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞触发活动:环境相关剂量（1 nM）BPA暴露后显著增加心肌细胞after-contraction及after-transient发生率。联合P4处理后,BPA诱导的这些心肌细胞触发活动被显著抑制。P4的这一抑制作用被特异性nPR阻断剂RU486阻断。2.P4抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞钙循环紊乱:（1）P4抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞SR钙负荷增加:BPA暴露后心肌细胞咖啡因诱导的钙瞬变峰值显著增加,而联合P4处理后,BPA引起的心肌细胞咖啡因诱导的钙瞬变峰值增加被显著抑制。P4的这一抑制作用被RU486阻断。（2）P4抑制BPA诱导的雌性大鼠心肌细胞SR钙离子漏:BPA暴露后心肌细胞钙火花频率显著增加,而联合P4处理后,BPA诱导的钙火花频率增加被明显抑制。P4的这一抑制作用也被RU486阻断。3.P4抑制BPA增加的PLN17磷酸化水平:BPA暴露显著增加心肌细胞RyR2808和PLN17的磷酸化水平,联合P4处理后,BPA诱导的PLN17磷酸化被明显抑制,而其诱导的RyR2808磷酸化未受影响。RU486阻断了 P4的这一抑制作用。4.P4对BPA的快速抑制作用通过依赖nPR的膜表面信号介导:与P4的抑制效应一致,非透膜性偶联牛血清蛋白孕酮（P4-BSA）明显抑制BPA诱导的心肌细胞触发活动、钙火花频率增加、以及PLN17磷酸化。P4-BSA的这些抑制效应均被RU486阻断。5.P4对BPA的抑制作用不依赖于cSrc激活:以PLN17磷酸化水平及心肌细胞after-contraction发生率作为评价指标,cSrc抑制剂PP2预处理不能阻断P4对BPA诱导的PLN17磷酸化及触发活动的抑制作用。6.抑制性G蛋白（inhibitory G protein,Gi）参与P4对BPA的抑制作用:以PLN17磷酸化水平及心肌细胞after-contraction发生率作为评价指标,Gi蛋白抑制剂PTX预处理完全解除P4对BPA诱导的PLN17磷酸化及触发活动的抑制作用。7.nPR-Gi-PI3K信号通路参与介导P4对BPA促雌性大鼠心律失常发生的抑制作用:以PLN17磷酸化水平及心肌细胞after-contraction发生率作为评价指标,PI3K抑制剂Wortmannin预处理完全阻断P4对BPA诱导的PLN17磷酸化及触发活动的抑制作用。进一步利用检测Akt的磷酸化水平显示,与正常对照组比较,P4组心肌细胞Akt磷酸化水平显著增加,而P4的这一效应能被RU486或PTX阻断。结论1.在离体雌性大鼠心肌细胞模型下,首次报道生理相关剂量P4对BPA促雌性大鼠心律失常发生具有保护作用。2.P4通过激活nPR-Gi-PI3K膜信号通路,阻断BPA诱导的PLN17磷酸化及SR钙转运紊乱,从而抑制BPA诱导的心肌细胞自发性触发活动。