论文部分内容阅读
前列腺癌是威胁人类健康的主要癌症之一,在欧洲和美国,前列腺癌的发病率多年来一直位居男性恶性肿瘤的首位,死亡率居第二位。虽然中国前列腺癌发病率低于欧美等国家,但近年来,随着人口老龄化、饮食结构改变、医疗诊断技术水平的提高和医疗体检的普及,我国前列腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。据估计,2015年我国前列腺癌新发病例约60300例,死亡病例约26600例。前列腺癌的传统的治疗为雄激素剥夺疗法,利用药物或手术方法降低病人的体内雄激素水平,从而达到治疗前列腺癌的目的。遗憾的是,在经过12-18个月的中位治疗时间后,大多数病人最终转归为去势/激素抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)。一旦出现激素抵抗,就目前的治疗水平来说,激素抵抗性前列腺癌对化学治疗和放射治疗皆不敏感,从而导致CRPC患者面临内分泌治疗无效后生活质量降低、生存期缩短等一系列影响。因此,研发新的有效的前列腺癌治疗药物和治疗手段成为CRPC前列腺癌治疗中亟待解决的关键问题。近年来,基于促进肿瘤细胞凋亡、改变细胞内信号传导途径等机制的分子靶向治疗、基因治疗方法受到人们的重视,如国内外学者杨高毅等研究发现下调bcl-2蛋白可以诱导前列腺癌细胞凋亡,并且发现bcl-2反义寡核苷酸oblimersensodium联合多烯紫杉醇治疗激素难治性前列腺癌的Ⅰ/Ⅱ期临床研究也显示出良好的治疗效果。另外,携带可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)基因的腺病毒可引起人体内肿瘤细胞发生明显的凋亡。其中,TRAIL引起了人们的关注。国内外对TRAIL及其介导的细胞凋亡途径的研究表明,TRAIL或其胞外域降解形成可溶性的细胞因子sTRAIL(Soluble TRAIL)可作用于靶细胞表面的死亡受体DR4和DR5而形成死亡诱导信号复合体,并激活caspase8及其下游的caspase级联反应,然后启动死亡受体途径和线粒体依赖的凋亡途径。其中死亡受体途径最终通过激活caspase3等效应酶,作用于蛋白激酶C(PKC)等底物而导致细胞凋亡。而线粒体依赖途径是通过形成有活性的tBid(truncated BID),使线粒体释放cytC等凋亡相关因子,再通过caspase3,7诱导肿瘤细胞凋亡。bcl2是该途径的抑制因子之一。另外,一些肿瘤细胞高表达诱骗受体DcR1、DcR2,它们可与DR4/DR5竞争同TRAIL的结合,抑制TRAIL介导的细胞凋亡,使肿瘤细胞表现出对TRAIL的耐受。然而,近年来,尽管人类等脊椎动物TRAIL蛋白的抗癌作用已有较多研究报道,但对前列腺癌PC3细胞的促凋亡作用则罕见报道,对其作用的详细的分子机制则未见报道,而对贝类等无脊椎动物的TRAIL基因及其重组蛋白的抗肿瘤功能国际上则更没有报道。在先前利用RT-PCR技术克隆池蝶蚌的免疫相关基因的过程中,我们获得了双壳贝类池蝶蚌的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(sTRAIL)基因的部分序列,并发现该TRAIL有一定的抗肿瘤特性。为深入探讨贝类sTRAIL基因的抗肿瘤作用及其可能的作用机制,我们拟通过本项目的研究进一步确定池蝶蚌的sTRAIL在抗肿瘤,即促进前列腺癌细胞PC3细胞凋亡方面的功能作用,并揭示其作用的死亡受体信号传导途径等可能的作用机制,从而将该蛋白作为新型抗癌药物,以及将TRAIL和相关信号分子作为靶向治疗的有效靶点运用于前列腺癌等癌症的治疗实践方法:1.利用RT-PCR和western-blot技术克隆池蝶蚌sTRAIL基因序列,并对sTRAIL基因进行原核表达、纯化获得多克隆抗体。2.利用不同浓度的(10ng-10 u g)河蚌sTRAIL重组蛋白对该细胞进行诱导刺激,利用流式细胞仪检测和DNAladder等检测法对sTRAIL诱导刺激0-96h后PC3的细胞凋亡现象进行了分析。3利用Real-time实时定量PCR和Western blotting技术检测sTRAIL重组蛋白诱导/未诱导的肿瘤细胞(PC-3)的DR4、DR5、DcR1、DcR2在mRNA和蛋白质水平上的表达变化。4 分别用 caspase8 抑制剂 Z-AEVD-FMK 和 caspase3 抑制剂 Ac-DEVD-CHO 处理经sTRAIL诱导的PC-3细胞,利用上述方法检测细胞凋亡情况,并检测抑制剂处理前后caspase8、caspase3、PKC等分子在mRNA和蛋白水平表达的变化。5在上述对死亡受体、caspase信号途径研究的基础上,用PKC抑制剂,Staurosporine处理经sTRAIL诱导的PC-3细胞,利用Real-time实时定量PCR和Western blotting技术检测细胞凋亡和抑制剂处理前后PKC等基因表达的变化。6.检测sTRAIL诱导后,PC-3细胞中抗凋亡因子bcl-2基因表达水平的变化。用bcl-2抑制剂(ABT-737,5nM)处理后,再次检测凋亡率。结果:1克隆了池蝶蚌sTRAIL蛋白序列,并证实了 sTRAIL蛋白对PC3细胞的毒性作用。2河蚌sTRAIL对PC3细胞具有较强的细胞毒性作用,可诱导PC3细胞发生显著的细胞凋亡,随着sTRAIL浓度和诱导时间的增加,PC3细胞的凋亡率逐渐增加,呈现明显的剂量与时间效应,其中100ngsTRAIL诱导组中,24h细胞凋亡率可达23.7%以上,并可检测到DNA ladder的形成。3对sTRAIL诱导后,PC3细胞中死亡受体DR4和DR5均有表达,但DR4较高;而诱骗受体DcR1和DcR2不表达.4 sTRAIL诱导可引起caspase8、caspase3基因表达水平的显著上调,同时伴随凋亡率的增加;用caspase8抑制剂Z-IETD-FMK或caspase 3抑制剂Ac-DEVD-CHO分别处理,均能显著下调凋亡率。5sTRAIL诱导可引起PKC基因表达水平的上调,但不显著;PKC抑制剂(Saurosporine)处理后,凋亡率明显下降,但仍显著高于对照组。6sTRAIL诱导后24h内可引起bcl-2表达上调,但不显著;用bcl-2抑制剂(ABT-737)处理后,凋亡率明显增加。结论:确定了池蝶蚌sTRAIL对前列腺癌细胞株(PC3)的促凋亡作用,并分析了sTRAIL诱导前列腺癌细胞株(PC3)发生细胞凋亡的死亡受体途径中相关的死亡受体、caspases、PKC、Bcl-2等分子的作用,确定了 TRAIL、DR4和bcl-2可作为PC3细胞靶向治疗的新靶点。