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目的:研究与ΔNp63结合的miRNAs对角质形成细胞分化功能的影响,并探讨其潜在的作用机制。方法:1.采用生物信息学方法选出与皮肤分化相关的差异miRNAs和靶基因,进一步预测其潜在的通路机制。2.通过qRT-PCR检测各阶段大鼠胚胎皮肤中ΔNp63的表达水平。3.加入氯化钙构建角质形成细胞分化模型,光镜下观察细胞形态,并采用qRT-PCR和Western blotting检测靶基因、差异miRNAs、通路和皮肤分化标记物的m RNA和蛋白的表达水平。4.转染差异miRNAs检测转染效率,通过qRT-PCR和Western blotting技术验证对角质形成细胞分化的影响,并检测靶基因和通路的表达情况。5.RNA FISH检测差异miRNAs的定位情况。6.双荧光素酶报告实验验证差异miRNAs与靶基因的匹配结合关系。7.构建慢病毒细胞株,回复实验验证差异miRNAs和靶基因对角质形成细胞分化的影响。8.采用MSP实验检测差异miRNAs启动子区域的甲基化状态来验证影响miRNAs转录的上游机制。9.甲基化抑制剂5-aza-d C处理角质形成细胞,利用qRT-PCR和MSP实验分析去甲基化后差异miRNAs启动子区甲基化状态。甲基化回复实验验证miRNAs启动子甲基化对角质形成细胞分化的影响。结果:1.生物信息学分析结果:通过人胚皮肤样本测序数据发现miR-125b-5p和miR-199b-5p的表达量随着皮肤发育的完全而减少。bibiserv网站筛选的结果发现miR-125b-5p和miR-199b-5p都能与ΔNp63结合。KEGG结果发现PI3K/AKT/m TOR等47个通路能被它们共同调控。2.随着大鼠胚胎皮肤发育的成熟,ΔNp63的表达显著增高。3.加入氯化钙对角质形成细胞分化的影响:光镜结果显示未分化的角质细胞呈鹅卵石状,细胞间隙明显且松散。随着角质细胞的分化,细胞变的扁平且紧密,细胞边界不清。qRT-PCR和Western blot结果表明ΔNp63、CK10、Inv、TG1和PI3K/AKT/m TOR的m RNA和蛋白表达水平随着角质细胞分化的程度而增高（P＜0.05）。miR-125b-5p和miR-199b-5p的m RNA表达水平却因角质细胞分化而显著下降（P＜0.05）。4.转染miR-125b-5p和miR-199b-5p对角质形成细胞分化的影响:与NC组相比,转染miRNA模拟物组细胞中miR-125b-5p、miR-199b-5p的表达显著增加（P＜0.05）。miRNA抑制剂组中miR-125b-5p和miR-199b-5p的表达显著降低（P＜0.05）,表明细胞转染成功。与NC组相比,转染miR-125b-5p和miR-199b-5p模拟物组中ΔNp63、CK10、Inv和TG1的m RNA和蛋白都下调,且PI3K/AKT/m TOR通路被抑制（P＜0.05）。转染miR-125b-5p和miR-199b-5p抑制剂可逆转上述效应（P＜0.05）。表明miR-125b-5p和miR-199b-5p可能调节ΔNp63影响PI3K/AKT/m TOR通路抑制角质形成细胞的分化。5.miR-125b-5p和miR-199b-5p靶向ΔNp63对角质形成细胞分化的影响:1)过表达ΔNp63慢病毒细胞发出的荧光比NC对照组的弱,表明慢病毒细胞系构建成功。与NC组对比,过表达ΔNp63慢病毒细胞中ΔNp63、CK10、Inv和TG1的蛋白都上调,并且PI3K/AKT/m TOR通路被激活（P＜0.05）。2)RNA FISH结果显示miR-125b-5p和miR-199b-5p主要定位于细胞质中,双荧光素酶报告实验证明miR-125b-5p和miR-199b-5p都与ΔNp63之间存在结合位点。miR-125b-5p和miR-199b-5p都能与ΔNp63的3’-UTR结合,负向调控其表达（P＜0.05）。提示miR-125b-5p和miR-199b-5p可以与ΔNp63靶向结合。3)细胞回复实验中,与过表达ΔNp63慢病毒+miR-125b-5p/miR-199b-5p模拟物组相对比,NC慢病毒+miR-125b-5p/miR-199b-5p模拟物组中ΔNp63、CK10、Inv、TG1和PI3K/AKT/m TOR通路蛋白都下调（P＜0.05）。6.miR-125b-5p和miR-199b-5p启动子甲基化状态对角质形成细胞分化的影响:1)角质形成细胞分化模型中miR-125b-5p和miR-199b-5p启动子区域的甲基化水平随着角质形成细胞的分化而显著升高（P＜0.05）。2)与氯化钙+DMSO组相比,氯化钙+甲基化抑制剂组显著抑制了ΔNp63、CK10、Inv、TG1和PI3K/AKT/m TOR的m RNA和蛋白表达水平（P＜0.05）;miR-125b-5p和miR-199b-5p启动子甲基化水平显著降低,m RNA表达水平明显升高（P＜0.05）。3)甲基化回复实验中,与miRNA抑制剂阴性对照+甲基化抑制剂组相比,甲基化抑制剂+miR-125b-5p/miR-199b-5p抑制剂组中ΔNp63、CK10、Inv、TG1和PI3K/AKT/m TOR通路蛋白表达水平显著增高（P＜0.05）。结论:1.随着表皮角质形成细胞的分化,miR-125b-5p和miR-199b-5p的表达逐渐降低。2.miR-125b-5p和miR-199b-5p可以靶向ΔNp63影响PI3K/AKT/m TOR抑制角质形成细胞的分化。3.启动子高甲基化介导miR-125b-5p和miR-199b-5p通过ΔNp63影响PI3K/AKT/m TOR通路促进角质细胞的分化。