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乙型肝炎病毒(HBV)感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且是肝纤维化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的主要病因。病毒基因组编码的蛋白通过反式调节宿主肝细胞基因组的表达,调控肝细胞的生长,可能是HBV致病(癌)的重要分子机制之一。HBV基因组具有4个主要的开放读码框架(ORF),分别命名为S、C、P、X区,其中X区编码154个氨基酸残基组成的17.5 kDa的产物-HBx。HBx是一种具有反式调节作用的病毒蛋白质,关于其反式调节作用,来自不同研究小组的实验结果甚至相互矛盾,因此,HBx在病毒复制和发病机制中的确切作用还有待进一步阐明。利用寡核苷酸基因芯片技术对HBx蛋白反式调节靶基因进行新的开拓,全面了解HBx蛋白反式调节作用的靶基因,有助于阐明HBV感染的部分分子生物学机制。 本课题首先应用常规分子生物学技术构建HBx蛋白的真核表达载体pcDNA3.1(-)-X,并将构建好的重组质粒瞬时转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,以空载体为平行对照。应用寡核苷酸基因芯片技术对HBx反式调节的靶基因进行筛选,同时结合生物信息学技术对差异表达的基因进行分析。在筛选的21,329条基因中,有426条差异表达的基因,其中168条基因表达上调,258条基因表达水平下调,这些基因包括许多与细胞生长调节、细胞凋亡、信号转导、免疫反应、物质代谢、细胞分裂周期、肿瘤发生和转移等相关的基因,还包括一些未知功能的新基因,其中之一命名为HBx蛋白反式激活基因11(XTP11)。 为进一步研究细胞中表达的HBx蛋白对抑癌基因p53的调节作用,我们利用生物信息学技术确定抑癌基因p53的启动子区域(p53p),构建真核报告基因表达载体pCAT3-p53p;以该质粒单独及与pcDNA3.1(-)-X共转染HepG2细胞,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果显示,克隆的p53启动子序列具有激活下游基因转录的活性,当pCAT3-p53p与pcDNA3.1(-)-X共转染时CAT的表达活性明显下降;进一步采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测表明,瞬时转染了pcDNA3.1(-)-X的HepG2细胞中p53基因mRNA表达减少。说明HBx蛋白在转录水平上反式抑