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下颌骨末端发育不良症(Mandibuloacral dysplasia,MAD,OMIM 248370)是一种罕见的常染色体隐性遗传病。由LMNA基因或ZMPSTE24基因突变引起,被归类于laminopathies。病人表现有出生后生长迟滞,脱发,下颌骨发育异常,肢端骨质溶解,关节僵直,皮肤萎缩及斑点色素沉着等,其中一些临床症状与HGPS相似。此外,病人还常常会伴有FPLD病人表现出的部分性脂肪营养不良和胰岛素抵抗。
目的：从分子遗传学、细胞学，探讨一例临床诊断为MAD-likelaminopathies的分子病因和发病机制。通过胰岛素干预,检测患者皮肤成纤维细胞葡萄糖摄取和葡萄糖氧化以及胰岛素信号通路,探讨该例MAD-likelaminopathies的胰岛素抵抗的分子机制。
方法：1.以该例患者皮肤和正常对照制备人皮肤成纤维细胞模型；收集详尽的临床资料,完成临床诊断与鉴别诊断。2.基因筛查外周静脉血提取人类基因组DNA,通过PCR-DNA直接测序法对目前明确的可导致核纤层蛋白病的责任基因进行基因筛查。这些基因包括LMNA、ZMPSTE24、INSR、PPARγ、WRN,筛查包括启动区域、外显子区、外显子内含子相邻拼接区。3.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)用Trizol方法，提取患者以及2名对照皮肤成纤维细胞中总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR反应扩增LMNA基因片断,而检测lamin A和lamin C基因表达。4.Northern blot检测LMNA基因剪切产物(lamin A/C)mRNA片断分析比较病例和对照RNA样品中lamin A和lamin C mRNA的大小和丰度。RNA经变性琼脂糖凝胶电泳分离,转印迹至尼龙膜等固相支持膜上,再与标记的特异性探针杂交,从而分析固定于膜上的mRNA的数量和大小探针序列选择lamin A和lamin C的共同序列,探针长度为450bp。5.实时荧光定量PCR采用Sybrgreen染料法,以β-actin为内参基因,对于LMNA、lamin A基因的mRNA表达量进行检测。6.皮肤成纤维细胞的原代培养(1) 皮肤成纤维细胞的分离和体外培养手术切取患者以及与患者年龄相当的2名对照腹部2～3cm的皮肤,反复经过PBS漂洗后,剪弃脂肪和结缔组织。加入含10％胎牛血清(Gibco BRL)的DMEM中,在37℃5％CO2孵箱中培养,每周换液2次,用0.25％胰酶(内含0.02％EDTA)消化传代。 (2) 皮肤成纤维细胞的传代培养当培养的皮肤成纤维细胞长成单层后,用0.25％胰酶(内含0.02％EDTA)消化传代,以1:2或1:4的比例传代。7.Western blot检测laminA/C蛋白表达。8.细胞学形态观察和鉴定。9.2-脱氧-D-[1-3H]葡萄糖直接检测法观察病例和对照的10代,15代,20代皮肤成纤维细胞基础和胰岛素刺激的葡萄糖摄取量。10.D-[U-14C]葡萄糖直接检测法观察病例和对照的10代,15代,20代皮肤成纤维细胞基础和胰岛素刺激的葡萄糖氧化情况。11.Western Mot检测皮肤成纤维细胞中调节胰岛素信号通路的关键物质胰岛素受体底物1(IRS1)和胰岛素信号通路P13K/Akt(磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B)途径关键分子P13K的总蛋白表达,基础和胰岛素干预后蛋白磷酸化的表达情况；实验设一个无干预的阴性对照,干预分为长时干预(24小时)和短时干预(10分钟),在细胞P10进行干预试验和蛋白表达检测。12.以统计学方法，每个实验均重复三次得到一致的结果,每次试验均由不同的人独立完成。计量资料用mean+/-SE表示,两组间比较采用t检验或ANOVA检验；统计处理采用statveiw5.0软件,P<0.05有显著性差异。
结果；1.本例患者临床诊断为MAD-like laminopathy。2.对LMNA、ZMPSTE24、INSR、PPARγ、WRN的DNA测序结果显示,LMNA、PPAR7和ZMPSTE24基因中没有发现任何变异,INSR和WRN基因的外显子和内含子中发现一些变异,这些变异是人群中存在的多态性,在国外均有报道。3.在传代早期(10代前)病例和对照的细胞在光镜下的形态无明显差异,表现为透亮的长梭状细胞,但传代至10代以后,光镜下可见病例皮肤成纤维细胞变得大而扁平,细胞核增大,细胞内异物增多,生长饱和密度下降,而对照的细胞能一直保持漂亮的长梭形。4.实时荧光定量PCR结果显示,病例皮肤成纤维细胞中LMNA与lamin A/C的表达量与正常人相当。结合DNA测序、RT-PCR以及northern blot的结果,病例的LMNA基因在DNA、mRNA水平上没有发生明显变化。5.Western blot检测LMNA基因的蛋白表达发现：lamin C的表达明显降低,表达量于对照相比降低了约94％(P＜0.05),而laminA的表达与比对照相比明显升高。6.对照成纤维细胞在传代过程中保持着长椭圆形的细胞核形态、边缘光滑,核孔正常分布,异染色质在核膜内侧呈放射状分布；电镜下可见细胞核形态发生明显改变。这些核结构缺陷随传代逐渐加重。7.为进一步观察本病例的细胞核结构与功能的异常,通过直接双色免疫荧光检测细胞和形态,lamin A/C的分布情况。对照成纤维细胞核呈规则卵圆形,lamin A/C与emerin在核膜上均匀分布。8.本病例皮肤成纤维细胞基础状态下和胰岛素刺激下的葡萄糖摄取量明显低于2对照细胞。9.本病例皮肤成纤维细胞基础状态下和胰岛素刺激下的葡萄糖氧化量明显低于2对照细胞。10.患者成纤维细胞中总IRS1和P13K蛋白表达均低于对照,患者P13K基础酪氨酸磷酸化表达增加；胰岛素作用后对照的P13K磷酸化水平升高,而患者与基础状态相比,无明显变化。
结论：1.从蛋白质水平、亚细胞水平、细胞水平及临床研究，明确了患者MAD-like laminopathy的诊断。2.lamin C缺陷与本例MAD-like laminopathy相关,是本例MAD-likelaminopathy的分子病因。3.lamin C蛋白的降解破坏核纤层蛋白层的完整性以及细胞核的稳定性,可能导致细胞核结构与功能的各种异常。4.本例laminC缺陷引起的MAD-like laminpathies患者胰岛素非依赖性的细胞葡萄糖代谢异常,胰岛素介导的细胞葡萄糖摄取和氧化功能受损。5.IRS1与PI3K总蛋白表达下调、PI3K明显的基础磷酸化、胰岛素介导的进一步酪氨酸磷酸化作用减弱,说明胰岛素信号通路受损是本病例胰岛素抵抗的分子机制。6.LaminC缺陷可能直接参与胰岛素抵抗发生的分子机制,通过某一未知介质与胰岛素信号通路上的分子相互作用。