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心血管疾病导致心源性猝死,是人类死亡的主要原因之一。心律失常是导致心源性猝死的直接原因。心律失常分为室性纤颤/室性心动过速和房颤。心律失常主要是由于心肌细胞离子流的异常所致,而离子通道控制着离子流。离子通道的基因突变导致遗传性心律失常。例如,1995年首次报道了钠通道Nav1.5的基因突变导致心律失常疾病长QT综合征的发生。电压门控钠离子通道Nav1.5对心脏动作电位的产生和传导都起着非常关键的作用。Nav1.5由SCN5A基因编码,目前已发现300多个SCN5A的遗传突变,导致Brugada综合征,长QT综合征、病态窦房结综合征,扩张性心脏病等。心脏钠通道是一个大的蛋白复合结构,包括Nav1.5、不同的?-亚基和许多其它相互作用蛋白如MOG1、CRYAB,SAR1A/SAR1B等,但是复合体的关键组成成分及每个组份调控Nav1.5的表达和功能的机制还有待深入研究。作为膜蛋白,Nav1.5在细胞膜表面的表达水平和它的功能息息相关,因为细胞的电活动不仅依赖于它的活性还依赖于它的表达水平。Nav1.5的泛素化在控制其膜表达量方面起着重要的作用,UPS(ubiquitin-proteasome system)系统的关键组分Nedd4-2和Nav1.5相互作用并调控Nav1.5的泛素化、内吞和降解。Nedd4-2是含有HECT催化结构域的泛素E3连接酶,Nav1.5包括PY(x PPx Y)基序,可以和Nedd4-2的WW结构域相互作用,泛素化是质膜蛋白内吞和降解的前提条件。SUMO化是另一种翻译后蛋白质修饰,对于蛋白质的稳定性起重要作用。UBC9是SUMO化的结合酶E2,与E3酶相互作用,在SUMO化修饰过程中帮助SUMO连接在底物蛋白上。Nav1.5的SUMO化修饰未有报道,因此我们原计划研究SUMO化对Nav1.5的影响。我们在HEK293-Nav1.5细胞中过表达UBC9,我们发现UBC9的可以调控Nav1.5的表达量和心脏钠电流密度,但是我们意外的发现,UBC9不是通过SUMO化修饰,而是通过调控Nav1.5的泛素化从而控制Nav1.5表达与功能。具体实验结果如下:(1)我们无论是在HEK293细胞中共转Nav1.5/UBC9和Nav1.5/p CMV-HA,还是在Nav1.5稳转细胞系HEK293-Nav1.5分别转染UBC9过表达质粒和空载,结果表明过表达UBC9下调了Nav1.5的表达水平。实验进一步表明,UBC9对Nav1.5的调控具有剂量依赖性。细胞膜上的Nav1.5发挥着钠通道的主要功能,过表达UBC9后,提取膜蛋白,结果表明,过表达UBC9下调细胞膜上的Nav1.5的表达水平;(2)我们在HEK293-Nav1.5细胞中过表达UBC9,经全细胞膜片钳技术检测,结果表明,过表达UBC9减小钠电流密度,但并不影响钠通道的稳态激活,稳态失活以及失活后恢复的动力学参数;(3)HEK293-Nav1.5细胞中用UBC9 si RNA干扰掉内源性UBC9,结果表明敲低UBC9后,Nav1.5上调。进一步研究表明在HEK293-Nav1.5细胞中敲低内源性UBC9后,钠电流密度增大,但并不影响钠通道的稳态激活,稳态失活以及失活后恢复的动力学参数;(4)在大鼠乳鼠心肌细胞中过表达和敲低UBC9,记录全细胞钠电流,结果显示,在乳鼠心肌细胞中,过表达UBC9减小钠电流密度,干扰UBC9增大钠电流密度;(5)我们构建了丧失SUMO结合活性的UBC9突变体UBC9 C93S,用已知的SUMO底物p53作为被修饰的目的蛋白,检测过表达UBC9和UBC9 C93S对p53的SUMO化影响,结果显示,过表达UBC9促进了p53的SUMO化,突变体UBC9 C93S抑制了p53的SUMO化。证明我们的UBC9系统是有效的。我们用UBC9及UBC9 C93S分别与Nav1.5共转,结果表明,过表达UBC9下调Nav1.5,突变体UBC9 C93S同样下调Nav1.5的表达水平,因此,我们的结果表明UBC9对Nav1.5的表达调控以独立于SUMO化修饰的方式;(6)过表达UBC9后,Nav1.5下调,蛋白酶体抑制剂MG132抑制了UBC9对Nav1.5的下调作用,同时,在HEK293细胞中和HEK293-Nav1.5细胞中过表达UBC9促进了Nav1.5的泛素化;(7)免疫共沉淀实验表明UBC9和Nedd4-2相互作用。以上研究表明,UBC9与Nedd4-2相互作用,通过泛素蛋白酶体途径调控Nav1.5的泛素化与降解,并且在异源性HEK293细胞和大鼠乳鼠心肌细胞中,调控Nav1.5钠电流密度。研究已经证实,在调控Nav1.5的泛素化系统中,Nedd4-2作为泛素E3连接酶调控Nav1.5的泛素化与降解,但是该系统中的关键组分泛素E2结合酶还没有被发现,而我们的研究结果表明,UBC9可能作为泛素E2结合酶调控Nav1.5的泛素化。我们的研究结果鉴定出一个Nav1.5泛素化修饰系统的关键结构组份,为研究Nav1.5的泛素化调控机制提供了重要的信息。对泛素系统各个组份的剖析对我们理解心脏钠通道复合体的结构,功能和调控非常重要,对研究心血管生理学,健康和疾病有着重要的意义。