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戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)所引起的病毒性肝炎。近年来,HEV已逐渐成为全球范围内引发急性病毒性肝炎的主要原因之一。孕妇与老年人是主要高危人群,戊型肝炎病例的病死率约为0.2～4%,孕妇感染HEV的病死率可高达10～25%。HEV是单股正链RNA病毒,基因组全长7.2 kb,包含3个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),其中ORF2负责编码戊型肝炎病毒唯一的衣壳蛋白,共包含660个氨基酸,该蛋白参与了病毒组装及病毒与细胞的相互作用。基于戊肝病毒ORF2重组表达了可以自组装成类病毒颗粒的截短蛋白p239(a.a.368-606),能够展示天然病毒的免疫优势中和表位,可用于研究HEV的早期入胞进程。HEV侵染宿主后,机体被激发的抗体免疫反应有效性需要基于中和实验进行评估。传统的HEV中和检测方法有real-time PCR以及免疫荧光斑点计数(immunofluorescence foci assay,IFA),real-time PCR通过定量检测吸附细胞的病毒的RNA,灵敏度高,但是操作繁琐,重复性不好;IFA可以检测到病毒入胞后的中和,但是时间成本高,病毒来源少。本研究建立了基于生物素偶联p239(p239-b)结合偶联链亲和素的APC进行荧光标记,并用流式细胞仪进行检测的高通量中和模型,可以应用于HEV特异性抗体和血清的中和检测。基于p239的中和模型主要应用于评估抗体对于HEV类病毒颗粒的吸附阻断,没有涉及到抗体对病毒入胞后的作用,因此我们需要建立基于HEV真病毒的中和模型用于评估抗体对病毒吸附、入胞、复制整个过程的中和作用。传统的IFA中和检测方法由于病毒体外感染效率不高,灵敏度低,阳性细胞数计数结果波动大,本研究中我们首次利用复制率较高的HEV基因3型Kernow病毒建立了中和模型。Kernow中和模型评估的结果显示与类病毒颗粒模型具有较好的相关性,并且利用Kernow中和模型证明了 HEV感染和疫苗免疫产生的中和抗体基本都是针对于p239的表位,阐明了类病毒颗粒中和模型可以应用于HEV抗体和血清的中和评估。应用类病毒颗粒中和模型评估结果显示恒河猴血清IgG水平和抗体中和滴度有较好的相关性,说明血清的中和抗体绝大多数是IgG。但是,机体对于抗原激发的IgM应答也会影响血清的中和抗体滴度,说明血清的中和抗体也有一部分是IgM。此外,对于IgG水平相当的疫苗免疫血清和病毒感染血清,病毒感染血清的中和抗体所占比例比疫苗免疫血清更高,也就是说,病毒感染相对于疫苗免疫的方式会激发机体更有效地产生中和抗体。我们在评估HEV特异性抗体对于Kernow病毒的中和实验中,意外地发现已知的HEV中和抗体8G12无法中和Kernow,分析发现是由于病毒的554位点突变导致的,这个位点的突变还会引起病毒在人血清中的免疫逃逸,在人群中有潜在的威胁性。综上所述,本研究建立了新型的高通量的类病毒颗粒中和模型,为HEV特异性抗体和血清的中和评估提供了一种新的检测手段。但是该模型仅限于评估抗体阻断类病毒颗粒吸附细胞的能力,对于涉及到病毒入胞后的复制过程,需要依赖于Kernow的中和模型,但是Kernow中和系统存在耗时长,病毒产量较低等缺点,不适用于大规模的中和检测实验。这两个中和检测模型优势互补,根据不同的实验需要进行选择,有利于HEV临床研究相关工作的开展。