粘液表皮样癌耐药机制的研究

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粘液表皮样癌,是人类涎腺恶性肿瘤当中一个很常见的类型。根据以往的报道,此恶性肿瘤占所有涎腺恶性肿瘤的百分之三十以上,占颌面部所有肿瘤的5%到10%。而临床上对于此种肿瘤的治疗方法还是以外科手术为主。化疗对于此种肿瘤的效果并不是非常理想,主要障碍主要在于用药之后产生的多药耐药(Multidrugresistance,MDR)。解决了多药耐药的问题,可以为治疗这种恶性肿瘤提供一个新的有效的治疗途径。MDR是指由于使用一种药物而对多种药物产生耐药性,降低了临床抗肿瘤药物的有效性。目前研究最广泛的耐药机制是细胞将药物泵出的膜转运蛋白。p-糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白(Multidrug resistance-associated protein,MRP)是与耐药相关的两个主要蛋白。细胞的生物学功能大部分是通过信号通路实现,根据对于信号通路的研究,可以反过来揭示细胞的生物学特性。通过阻断这些和疾病相关的信号通路,可以达到研究和治疗的目的。我们在前期研究中建立了MC3/5-FU的耐药细胞系,可以和MC3细胞系进行对照。设计多条shRNA片段构建表达载体DNA,对体外培养的人粘液表皮样癌耐药细胞MC3/5-FU进行稳定转染,检测转染效率、检测细胞MDRl基因的mRNA的表达,筛选出更加有效的shRNA片段进行后续研究。检测RNA干扰后细胞耐药逆转率。检测MC3/5-FU和MC3之间信号通路活性差异,寻找耐药相关通路。抑制各通路活性后检测耐药逆转率以及生物学特性。通过抑制各通路活性后检测MDR1表达,并且RNAi沉默MDR1后检测各通路活性,从而推导各耐药相关通路与MDR1之间关系。检测RNAi与抑制各通路表达的抑制剂共同干预MC3/5-FU后耐药逆转率。RNAi沉默MRP1后检测MDR1以及信号通路表达,推测MRP1参与粘液表皮样癌耐药机制。主要研究内容及结果第一部分RNAi逆转MC3/5-FU耐药性用MTT法检测MC3/5-FU耐药倍数,对于诱导药物5-FU耐药倍数为16.7达到高度耐药。针对MDR1基因根据siRNA设计原则设计3条shRNA并分别用脂质体转染MC3/5-FU细胞,real time-PCR检测,片段1沉默效果最佳,并筛选出片段1的稳定转染细胞株,RT-PCR检测细胞细胞MDR1基因表达,测定转染后细胞株耐药倍数及耐药逆转率。转染后细胞株MDR1基因表达量下降,MC3/5-FU细胞对5-FU、BLM、VCR和VBL耐药逆转率分别为达到70.6%、40.8%、48.6%和58.8%。第二部分抑制信号通路逆转MC3/5-FU耐药性通过western blot方法找出MC3/5-FU细胞和MC3细胞之间差异的耐药相关细胞信号蛋白,MC3/5-FU细胞中NF-κB、Nrf2-ARE、MAPK/ERK活性明显高于MC3细胞。用抑制剂抑制NF-κB、Nrf2-ARE和MAPK/ERK后MC3/5-FU细胞对5-FU的耐药逆转率分别为67.7%、43.4%和54.3%。。用MTT法测定抑制后MC3/5-FU生长曲线,软琼脂克隆实验计算各种干预后细胞克隆数,可见各种干预后Nrf2-ARE组生长最快,NF-κB和MAPK/ERK组最慢。第三部分耐药相关信号通路在粘液表皮样癌中与MDR1基因之间的关系用RT-PCR和western blot.检测耐药相关信号通路在粘液表皮样癌中与MDR1基因之间的关系。 NF-κB、Nrf2-ARE和MAPK/ERK通路活性被抑制后MC3/5-FU细胞MDR1mRNA表达降低,NF-κB通路效果最明显。RNAi沉默MC3/5-FU中MDR1的表达后可见各通路活性未发生明显变化。抑制剂与RNAi共同作用后检测耐药逆转率与RNAi组无明显差异。第四部分MRP1基因引起耐药的机制用免疫组化实验检测MEC临床手术标本发现MRP1基因在MEC中表达,且与MDR1基因的表达关系密切。用RNAi沉默MRP1基因后RT-PCR检测发现MDR1基因表达被抑制。沉默MRP1基因后western blot方法检测Nrf2-ARE通路的活性被明显抑制。结论:1MDR1基因的表达是粘液表皮样癌细胞产生多药耐药的一个重要因素。2用RNAi的方法沉默MDR1基因可以有效逆转粘液表皮样癌细胞的耐药性。3NF-κB、Nrf2-ARE、MAPK/ERK参与粘液表皮样癌细胞的耐药过程,通过抑制这些通路可以逆转粘液表皮样癌细胞的耐药性。4NF-κB通路在粘液表皮样癌细胞中与MDR1基因的表达关系密切。5推测在粘液表皮样癌细胞中,MRP1可以激活Nrf2-ARE从而促进MDR1基因表达,导致细胞耐药。而不是传统认为的膜蛋白药泵作用。
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