酶解海湾扇贝裙边制备抗菌肽的研究

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海湾扇贝(Argopecten irradias)是我国沿海养殖中规模较大的海产品,具有极高的营养价值和经济价值。贝柱(属于扇贝的闭壳肌)是海湾扇贝中主要的食用部分,被作为主要的加工产品,而扇贝加工的副产物——裙边则被作为废弃物丢弃,造成了资源的大量浪费和环境污染。扇贝裙边富含蛋白质,是优质的海洋蛋白来源,可以通过酶解产生抗菌肽。抗菌肽因抑菌机制机制独特,抗菌谱广,不产生抗药性,安全无污染,引起了国内外学者的兴趣。本文以扇贝裙边为原料,通过酶解、超滤分离得到活性肽,再经比浊法筛选抗菌肽,为扇贝裙边的开发利用和进一步加工提供理论依据。酶解扇贝裙边制备抗菌肽扩大了海洋蛋白来源抗菌肽的种类和数量,具有积极的现实意义和经济价值。本文在前期研究的基础上选用六种常见的商业蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶)对扇贝裙边进行酶解。为了最大限度的的获得海洋蛋白来源的抗菌肽,酶解试验以水解率为判定指标,论文从六种蛋白酶中筛选出水解率最高的碱性蛋白酶和中性蛋白酶作为适用酶。通过优化筛选影响水解率的单因素试验条件,选择水解温度、pH值、酶与底物比、底物浓度四个显著因素对扇贝裙边酶解工艺进行正交试验设计优化,判定指标为水解率。得到碱性蛋白酶酶解扇贝裙边的最佳工艺条件为:pH为11、底物浓度为9%、反应温度40℃、[E]/[S]为12%,水解时间4h,在此最佳条件下水解率最大,为36.04%;中性蛋白酶酶解扇贝裙边的最佳工艺条件为:pH为9、底物浓度为4%、反应温度40℃、[E]/[S]为13%,水解时间4h,在此最佳条件下水解率最大,为28.83%。采用超滤技术对扇贝裙边水解液进行分离纯化。首先将扇贝裙边水解液通过4℃,10000r/s离心20min,收集上清液通过0.45μm水系滤膜过滤,去除杂质。采用四个不同分子量的超滤膜(1kDa、3kDa、5kDa、10kDa)对滤液进行分离,获得SSPH-Ⅰ(<1kDa)、SSPH-Ⅱ(1kDa~3kDa)、SSPH-Ⅲ(3kDa~5kDa)、SSPH-Ⅳ(5kDa~10kDa)、SSPH-Ⅴ(>10kDa)五个不同分子量的组分。对不同组分的水解液进行冷冻干燥。利用杯碟法和比浊法对获得的活性肽进行抑菌性的筛选,通过比较两种方法的优劣,最终确定比浊法为检验活性肽抑菌性的主要方法。通过筛选可知,碱性蛋白酶酶解液SSPH-Ⅱ(1kDa~3kDa)和中性蛋白酶酶解液SSPH-Ⅱ(1kDa~3kDa)、SSPH-Ⅲ(3kDa~5kDa)具有抑菌效果。利用微量稀释法测定这三个组分的最低抑菌浓度为:碱性蛋白酶扇贝裙边酶解液SSPH-Ⅱ(1kDa~3kDa)对大肠杆菌的MIC值为40μg/ml,对金黄色葡萄球菌的MIC值为80μg/ml;中性蛋白酶扇贝裙边酶解液SSPH-Ⅱ(1kDa~3kDa)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值均为80μg/ml;中性蛋白酶扇贝裙边酶解液SSPH-Ⅲ(3kDa~5kDa)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值均为40μg/ml。文章为酶解扇贝裙边制备抗菌肽提供了理论依据和数据支持。
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