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结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一,对人类健康有着严重影响。虽然目前治疗手段不断增多,医疗技术不断改善,使结直肠癌患者的生存率得到了显著提高。但因结直肠癌存在根治困难、易发生复发转移等特点,仍对患者的长期生存率产生了严重威胁。因此,深入研究结直肠癌的发生发展、增殖、侵袭、转移、凋亡异常等机制,寻找针对性的治疗方法具有重要意义。 黏蛋白型O-聚糖是由α-N-乙酰氨基半乳糖转移酶等催化合成的一类复合物。早期已有研究发现,T-合酶是将Tn抗原转化为Corel结构即T抗原的关键糖基转移酶,T抗原再继而合成多种多样的O-聚糖结构。Cosmc是位于Xq24位染色体的外显子基因,其编码了T-合酶合成所需的特异性分子伴侣Cosmc。一旦Cosmc发生突变则导致T-合酶功能异常,从而不能形成正常的O-聚糖结构,最终导致Tn抗原暴露。 程序性细胞死亡是细胞重要的生物学行为之一,而细胞凋亡异常与人类众多肿瘤的发生发展密切相关。因此,诱导细胞凋亡是肿瘤极具前景的治疗方案。通过肿瘤坏死因子(TNF)诱导肿瘤细胞凋亡是目前的研究热点,然而由于其严重的毒副反应,造成其应用受限。而肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族成员之一,其可特异性杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞无损伤,因此可作为一种新型的抗肿瘤药物。TRAIL发挥抗肿瘤作用与死亡受体DR4、DR5及caspase家族密切相关。 目的: 本研究拟从T-合酶特异性分子伴侣Cosmc异常为视角探讨O-聚糖结构缺陷对TRAIL诱导的人结直肠癌细胞凋亡的影响。 方法: 1.流式细胞技术检测转染Cosmc组细胞株的Tn抗原变化。 2.黏蛋白型O-聚糖对结直肠癌细胞的凋亡影响。 (1)CCK-8细胞毒性实验观察转染Cosmc组细胞株及空转细胞株对TRAIL诱导的细胞凋亡有无差异; (2)PE AnnexinⅤ/7-AAD细胞凋亡实验再次验证转染Cosmc组细胞株及空转细胞株对TRAIL诱导的细胞凋亡有无差异; (3)Western blot技术对比转染Cosmc组细胞株及空转细胞株TRAIL凋亡通路中的相关蛋白表达情况; (4)Western blot技术对比转染Cosmc组细胞株及空转细胞株胞膜表面TRAIL的凋亡受体表达情况。 结果: 1.流式细胞技术检测两组感染细胞Tn抗原的变化 流式细胞技术检测转染Cosmc组细胞株的Tn抗原变化。 结果:显示:LS174T(Tn+)-Cosmc组细胞较LS174T(Tn+)-Control组细胞Tn抗原表达明显降低。 2.TRAIL诱导两组转染细胞凋亡 (1)CCK-8细胞毒性实验比较两组转染细胞的凋亡差异。 不同浓度的TRAIL处理两组转染细胞24h均可抑制细胞增殖,细胞存活数目与药物浓度呈负相关(P值均<0.05),且转染Cosmc组细胞较Control组细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡更为敏感,尤其当TRAIL浓度为40ng/ml时(P=0.001)。 (2)流式细胞技术检测细胞凋亡 通过流式细胞技术检测发现,以40ng/ml浓度的TRAIL诱导两组转染细胞凋亡后,转染Cosmc组细胞株对TRAIL诱导的细胞凋亡更为敏感,且两组细胞凋亡差异具有统计学意义(P<0.0001)。 (3)TRAIL通路中凋亡蛋白的表达情况 Western blot实验结果显示:TRAIL诱导转染细胞凋亡后,两组转染细胞TRAIL凋亡通路中凋亡蛋白表达水平均增高,然而转染Cosmc组细胞较对照组细胞TRAIL通路中凋亡蛋白表达水平升高更为显著。 (4)TRAIL的凋亡受体表达情况 Western blot实验结果显示:转染Cosmc组细胞与Control组细胞TRAIL凋亡受体DR4/DR5的表达量无明显差异,但转染Cosmc组细胞DR4的高分子黏蛋白形式较Control组细胞表达明显增多。 结论: T-合酶特异性分子伴侣Cosmc可修复LS174T(Tn+)的O-聚糖形成过程,使Tn抗原转阴。O-聚糖结构缺陷可以抑制TRAIL诱导的细胞凋亡。