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目的Leber遗传性视神经病变（Leber hereditary optic neuropathy，LHON）是一种主要累及视盘黄斑束纤维，导致视神经退行性变的母系遗传性疾病。多见于男性，成年早期发病。该病1871年由德国眼科医生Theodor Leber首先报告为一种独立性疾病，1988年Wallace和他的同事发现该病患者mtDNA第11778位点存在单个核苷酸的替换，由鸟嘌呤G替换为腺嘌呤A，此突变造成呼吸链上还原型辅酶Ⅰ（NADH）脱氢酶第四个亚单位（ND4）基因编码的第340位氨基酸由精氨酸变为组氨酸。此后又有其他位点突变相继被发现，目前报道有20多个突变位点与此病有关。从临床、遗传学、生化等方面看，因为线粒体DNA第11778、14484、3460位点突变能单独致病，被称为原发突变位点，其他位点突变被看作是继发突变。11778、14484、3460三个位点的突变分别导致了呼吸链上还原型辅酶Ⅰ的ND4、ND6、ND1三个亚单位的氨基酸替换，绝大多数病人的发病是由此三个原发突变所导致，但三者的表达、严重程度和视力的恢复不同。对mtDNA的分子生物学检测有助于疑似病例，尤其是散发病人的确诊。目前国内已有人开始从事此方面的工作，但仅限于对11778、14484和3460三个原发突变位点的检测，方法也多采用限制性片断长度多态性和突变特异性引物聚合酶链反应，其他位点突变的研究尚未见报道。本研究在对5个LHON家系调查的基础上，采用聚合酶链反应扩增结合单链构象多态性分析（PCR-SSCP）和DNA测序，对三个家系的30个母系成员的血样进行了11个位点的分子生物学检测，目的是研究LHON的发病特点及分子生物学改变；为LHON的诊断、治疗、发病机制的研究提供参考依据；早日确诊疑似病人，使其避免不必要的治疗；为病人及其家系成员的就业、婚育作出指导；郑州大学2（X）1研究生毕业论文让bet遗传性视神经病变的分子生物学检测 材料与方法共调查了河南、安徽两省5个符合临床诊断的LHON家系，其中三个家系同意检测，在这三个家系中抽取了母系成员的血样30份作为实验组，抽取无视力障碍的正常人血样32份作为对照组，两组的男女比例（x’=0 .06，挤0.81）及年龄分布 （t=0.72，p二0.47）相匹配。在无菌条件下抽取外周静脉血，2%EDTA抗凝，有机酚法提取DNA。752紫外线分光光度计进行DNA定量及纯度测定，用4对引物聚合酶链反应扩增出4个线粒体DNA片断，涵盖3394、3460、4136、4160、4216、11696、11778、14459、14482、14484、14498共11个突变位点，琼脂糖凝胶电泳验证DNA扩增产物的产量和纯度。扩增产物用于单链构象多态性分析和DNA测序（DNA sequencing）。本实验的参照mtDNA序列是剑桥标准mtDNA序列。 结果5个家系的母系成员共78人（男36人，女42人），发病31人，发病率39. 74%，男女比例20:11，平均发病年龄29.01岁。男性外显率55.55%，女性外显率26.19%。其中三个家系（樊氏、毛氏、石氏）患者发病年龄随传递代数的增加而减小，呈现遗传早发现象。用第一对引物p，、PZ扩增340bp片段（片段1），自npl 1641至npll980，其中含11778、11696两个位点。实验组30例单链构象多态性（SSCP）检测结果全部为异常，对照组32例SSCP检测结果全部正常。对片段1测序，测序结果与剑桥标准mtDNA序列比对，30个实验组样本均含有1 1778位点突变，对照组均无此位点的突变。实验组和对照组所有样本都出现11719位点的突变。11696位点测30个样本，其中实验组19个，对照组11个，均未发生突变。第二对引物P3、p;扩增338bp片段（片段2），自np14200到np14538，其中含14459、14482、14484、14498四个位点，SSCP检测发现仅一例 LHON病人的结果有异常，反复验证排除假阳性，其余29人未发现异常，对照组32人均未发现异常。片段2测序23个样本，其中实验组14个，对照组9个，所含4个目的位点均未发生突变。SSCP检测中结果异常的一个样品，多次测序均因为峰图紊乱而无法判读结果。第三对引物PS、P。扩增307bp片段，自np3357到np3663，其中含3394、3460两个位点，实验组和对照组的所有样本经SSCP检测均未发现异常。实验组和对照组各测4个样品，均未发现突变。第四对引物P7、p。扩增327bp片段，自np4032到np4358，含4136、4160、4216三个位点，实验组和对照组的所有样本经SSCP检测均未发现异常，片段4测序31个样品，其中实验组19个，对照组12个，所含3个目的位点均未发现突变。测序中发现实验组一个样品携带4164位点AG突变，此突变使酪氨酸替换为半郑州大学2001研究生毕业论文Uber遗传性视神经病变的分子生物学检测肤氨酸，对照组发现一个样品携带4149位点CT突变，此突变使丙氨酸替换为撷氨酸。 结论（1） LHON患者发病年龄随传递代数的增加而提前，可能具有遗传早发现象。（2）综合国内的文献资料和我们的研究结果，我国LHON患者以携带1 1778点突变占绝大多数，1 1778位点突变的检测应作为诊断LHON的常规检测。（3） SSCP分析和测序相结合是目前LHON检测的较理想的方法。（4）三个家系有共同的突变位点，但只有部分发病，其中己发病者可确诊为LHON患，未发病的母系成员为该病的携带者。（5）测序中发现的4164位点突变，是该病新的继发突变位点