【摘 要】
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该研究以猪α干扰素重组质粒PGEX-IFN为模板,运用常规PCR方法扩增得到猪α干扰素基因的成熟编码序列.将此基因与毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA连接,构建pPICZαA-IFN重组质
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该研究以猪α干扰素重组质粒PGEX-IFN为模板,运用常规PCR方法扩增得到猪α干扰素基因的成熟编码序列.将此基因与毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA连接,构建pPICZαA-IFN重组质粒,并用常规CaCl<,2>法转化大肠杆菌JM109进行扩增.提取重组质粒,酶切、PCR扩增和DNA序列分析鉴定阳性克隆.阳性重组质粒经纯化处理后用BioRad公司电转仪电转化毕赤酵母菌株KM71H.抗生素Zeocin浓度梯度筛选高拷贝菌株,分别提取这些高拷贝菌株的基因组DNA,以此为模板做PCR反应鉴定阳性克降.经上述实验过程筛选出的高拷贝重组菌株分别通过BMGY/BMMY培养基和YPG培养基、用甲醇诱导表达,诱导菌液上清通过三氯醋酸沉淀蛋白处理,做SDS-PAGE和Western印迹实验,结果表明表达产物为重组猪α干扰素融合蛋白.将筛选出来的重组菌株诱导的144小时,取菌液上清液用VSV/WISH系统检测重组蛋白的抗病毒活性为4.1*10<4>IU/mL.
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