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棉酚是一种存在于棉属植物中的有毒次级代谢产物，其存在阻碍了棉副产品作为饲料原料的应用。反刍动物瘤胃中庞大的微生物体系对其耐受或降解棉酚具有至关重要的作用。在瘤胃微生物降解或代谢棉酚的过程中，棉酚对瘤胃微生物种群和代谢具有怎样的影响仍不清楚。本文旨在运用组学的方法检测棉酚对绵羊瘤胃微生物的影响及分析棉酚降解菌降解棉酚的机制，为今后深入研究瘤胃微生物耐受(生物降解)棉酚的机制提供数据支持。为此开展的试验研究如下：
试验一：棉酚对绵羊瘤胃微生物种群多样性、功能和代谢的影响
试验选取8只安装有永久性瘤胃瘘管的哈萨克羊母羊随机分为2组，试验组和对照组。试验组与对照组添加相同基础日粮，试验组在试验期第1~27天在基础日粮中每天每只羊添加600mg棉酚，在试验期第28~47天每天每只羊棉酚添加量增加至1,200mg，采集添加棉酚后第5、10、15、20、32、37、42、47天瘤胃液样品，检测瘤胃液挥发性脂肪酸浓度、棉酚浓度、原虫数量、瘤胃液微生物种群和代谢变化。
检测绵羊瘤胃液挥发性脂肪酸浓度、棉酚浓度和原虫数量结果显示：添加棉酚对绵羊瘤胃液总挥发性脂肪酸浓度无显著影响(P＞0.05)。添加棉酚后绵羊瘤胃液棉酚浓度随着添加剂量的增加而升高，当添加剂量相同时瘤胃液棉酚浓度无显著变化。添加棉酚后第20天瘤胃液中总原虫数量显著降低(P＜0.05)，棉酚对其它各时间点瘤胃液总原虫数量无显著影响(P＞0.05)。
瘤胃液中细菌物种多样性研究结果显示：与对照组相比，棉酚显著升高了第20天瘤胃液细菌区系物种丰富度(P＜0.05)，以及第37天瘤胃液细菌物种多样性和丰富度(P＜0.05)，但是对第47天瘤胃液细菌物种多样性和丰富度无显著影响(P＞0.05)。在门水平上，棉酚显著升高了螺旋体门相对丰度(P＜0.05)。在属水平上，棉酚显著升高了第20天瘤胃球菌科_NK4A214相对丰度(P＜0.05)，显著降低了Sphaerochaeta相对丰度(P＜0.05)，棉酚对第37天瘤胃液细菌属水平相对丰度无显著影响(P＞0.05)，棉酚显著升高了第47天瘤胃杆菌属和琥珀酸单胞菌属相对丰度(P＜0.05)，但是棉酚对瘤胃液细菌优势菌属无显著影响(P＞0.05)。结果表明，棉酚显著影响了第20天和37天瘤胃液细菌物种丰富度，但是对第47天瘤胃液细菌多样性和丰富度无显著影响。棉酚对瘤胃液细菌优势菌属无显著影响。
瘤胃液中真菌物种多样性的研究结果显示：绵羊饲喂棉酚后第20和47天，试验组与对照组相比，瘤胃液真菌区系物种多样性和丰富度差异不显著(P＞0.05)。第37天时，试验组瘤胃液真菌区系物种多样性显著高于对照组(P＜0.05)。在属水平上，添加棉酚显著升高了第37天毛霉菌属和第47天Metschnikowia相对丰度(P＜0.05)。结果表明，添加棉酚第20和47天，瘤胃液真菌多样性和丰富度无显著影响，添加棉酚第37天时显著提高了绵羊瘤胃液真菌多样性，但棉酚对绵羊瘤胃液真菌优势菌群组成无显著的影响。
瘤胃液中原虫物种多样性的研究结果显示：添加棉酚对不同时间瘤胃液原虫区系物种多样性和丰富度无显著影响(P＞0.05)，棉酚显著升高了第37天头毛属相对丰度(P＜0.05)，对瘤胃液原虫属水平上结构无显著影响(P＞0.05)。结果表明，在本试验条件下棉酚对绵羊瘤胃液原虫种群多样性、丰富度、原虫结构无显著影响。
瘤胃液微生物宏基因组研究结果显示：CAZy注释中大多数基因注释到糖苷水解酶，组间功能差异的Metastat分析差异前35的基因相对丰度均显著升高。eggNOG数据库比对后，注释信息最多的是未知功能的基因，其次是碳水化合物的转运和代谢。LEFse分析结果显示细胞骨架相关功能基因相对丰度显著降低，而翻译、核糖体结构和生物发生，碳水化合物转运和代谢以及无机离子转运与代谢相关功能基因相对丰度显著升高。KEGG组间功能差异的Metastat分析结果显示，棉酚显著降低了细胞活力相关功能基因相对丰度。结果表明，棉酚可能通过破坏细胞结构，降低细胞活力来抑制瘤胃液微生物生长。
瘤胃液代谢组学研究结果显示：正离子模式下，共检测到代谢产物1839个，试验组与对照组相比差异代谢物有32个，其中17个上调，15个下调。在负离子模式下，共检测到1120个代谢物，试验组与对照组相比差异代谢物有20个，其中上调和下调代谢物分别为12个和8个。在负离子模式下，差异代谢物富集分析结果显示苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、多环芳烃降解、苯甲酸盐降解通路差异显著。结果表明，瘤胃微生物对棉酚的降解可能与其它芳香烃类物质相同。
试验二：棉酚降解菌的分离鉴定及其棉酚降解机制的研究
以棉酚作为唯一碳源的基础培养基筛选棉酚降解菌，同时结合传统生理生化与分子生物学方法鉴定分离得到的棉酚降解菌。结果显示，分离得到三株棉酚降解菌命名为GD2、GD5、GD8。三株棉酚降解菌在筛选培养基中菌落形态为圆形，白色，革兰氏染色为革兰氏阴性。16SrDNA鉴定结果显示三株棉酚降解菌分别为克雷伯氏菌菌属、肠杆菌属、考氏科萨克氏属，进一步检测棉酚与棉酚降解菌共培养72h后棉酚降解率，三株棉酚降解菌棉酚降解率分别可达31.67%、33.74%、18.33%。
运用RNA测序方法检测肠杆菌GD5转录基因的变化。结果显示，培养72h后，共检测得到132个差异基因，其中上调基因104个，下调基因28个。GO富集结果显示差异基因主要富集到生物过程和分子功能，其中显著影响了稳态过程。进一步分析发现添加棉酚组肠杆菌GD5细胞抗氧化应激相关基因表达显著上调。KEGG富集通路中棉酚显著影响了丙酮酸代谢。结果表明，棉酚诱导肠杆菌GD5氧化应激，导致肠杆菌GD5抗氧化应激基因表达显著上调，这可能是肠杆菌GD5耐受或是降解棉酚的原因。
运用LC-MS的方法检测添加棉酚后肠杆菌GD5培养液代谢物变化。结果显示，试验组与对照组相比在正离子模式下共检测到差异代谢物有9个，其中4个显著上调，5个显著下调。在负离子模式下，差异代谢物有6个，其中显著上调和下调代谢物分别为4个和2个。差异性代谢物通路富集结果显示，在正负离子模式下棉酚均影响了谷胱甘肽代谢，并且在负离子模式下差异性代谢物显著富集到了氨基酸生物合成过程。结果表明，肠杆菌GD5可能通过谷胱甘肽代谢起到棉酚降解作用。
综上所述，添加棉酚后对绵羊瘤胃液细菌、真菌、原虫优势属无显著影响，但对细胞骨架、细胞活性相关基因相对丰度和芳香烃类物质代谢有关的代谢物具有显著影响。体外试验证明，添加棉酚后诱导了肠杆菌GD5氧化应激，因此肠杆菌GD5抗氧化应激相关基因表达显著上调，代谢组学结果显示棉酚影响了细菌谷胱甘肽代谢，并且棉酚显著影响了肠杆菌GD5氨基酸的生物合成过程。本研究结果为开展瘤胃微生物耐受棉酚或生物降解棉酚的机制提供了重要科学资料。
试验一：棉酚对绵羊瘤胃微生物种群多样性、功能和代谢的影响
试验选取8只安装有永久性瘤胃瘘管的哈萨克羊母羊随机分为2组，试验组和对照组。试验组与对照组添加相同基础日粮，试验组在试验期第1~27天在基础日粮中每天每只羊添加600mg棉酚，在试验期第28~47天每天每只羊棉酚添加量增加至1,200mg，采集添加棉酚后第5、10、15、20、32、37、42、47天瘤胃液样品，检测瘤胃液挥发性脂肪酸浓度、棉酚浓度、原虫数量、瘤胃液微生物种群和代谢变化。
检测绵羊瘤胃液挥发性脂肪酸浓度、棉酚浓度和原虫数量结果显示：添加棉酚对绵羊瘤胃液总挥发性脂肪酸浓度无显著影响(P＞0.05)。添加棉酚后绵羊瘤胃液棉酚浓度随着添加剂量的增加而升高，当添加剂量相同时瘤胃液棉酚浓度无显著变化。添加棉酚后第20天瘤胃液中总原虫数量显著降低(P＜0.05)，棉酚对其它各时间点瘤胃液总原虫数量无显著影响(P＞0.05)。
瘤胃液中细菌物种多样性研究结果显示：与对照组相比，棉酚显著升高了第20天瘤胃液细菌区系物种丰富度(P＜0.05)，以及第37天瘤胃液细菌物种多样性和丰富度(P＜0.05)，但是对第47天瘤胃液细菌物种多样性和丰富度无显著影响(P＞0.05)。在门水平上，棉酚显著升高了螺旋体门相对丰度(P＜0.05)。在属水平上，棉酚显著升高了第20天瘤胃球菌科_NK4A214相对丰度(P＜0.05)，显著降低了Sphaerochaeta相对丰度(P＜0.05)，棉酚对第37天瘤胃液细菌属水平相对丰度无显著影响(P＞0.05)，棉酚显著升高了第47天瘤胃杆菌属和琥珀酸单胞菌属相对丰度(P＜0.05)，但是棉酚对瘤胃液细菌优势菌属无显著影响(P＞0.05)。结果表明，棉酚显著影响了第20天和37天瘤胃液细菌物种丰富度，但是对第47天瘤胃液细菌多样性和丰富度无显著影响。棉酚对瘤胃液细菌优势菌属无显著影响。
瘤胃液中真菌物种多样性的研究结果显示：绵羊饲喂棉酚后第20和47天，试验组与对照组相比，瘤胃液真菌区系物种多样性和丰富度差异不显著(P＞0.05)。第37天时，试验组瘤胃液真菌区系物种多样性显著高于对照组(P＜0.05)。在属水平上，添加棉酚显著升高了第37天毛霉菌属和第47天Metschnikowia相对丰度(P＜0.05)。结果表明，添加棉酚第20和47天，瘤胃液真菌多样性和丰富度无显著影响，添加棉酚第37天时显著提高了绵羊瘤胃液真菌多样性，但棉酚对绵羊瘤胃液真菌优势菌群组成无显著的影响。
瘤胃液中原虫物种多样性的研究结果显示：添加棉酚对不同时间瘤胃液原虫区系物种多样性和丰富度无显著影响(P＞0.05)，棉酚显著升高了第37天头毛属相对丰度(P＜0.05)，对瘤胃液原虫属水平上结构无显著影响(P＞0.05)。结果表明，在本试验条件下棉酚对绵羊瘤胃液原虫种群多样性、丰富度、原虫结构无显著影响。
瘤胃液微生物宏基因组研究结果显示：CAZy注释中大多数基因注释到糖苷水解酶，组间功能差异的Metastat分析差异前35的基因相对丰度均显著升高。eggNOG数据库比对后，注释信息最多的是未知功能的基因，其次是碳水化合物的转运和代谢。LEFse分析结果显示细胞骨架相关功能基因相对丰度显著降低，而翻译、核糖体结构和生物发生，碳水化合物转运和代谢以及无机离子转运与代谢相关功能基因相对丰度显著升高。KEGG组间功能差异的Metastat分析结果显示，棉酚显著降低了细胞活力相关功能基因相对丰度。结果表明，棉酚可能通过破坏细胞结构，降低细胞活力来抑制瘤胃液微生物生长。
瘤胃液代谢组学研究结果显示：正离子模式下，共检测到代谢产物1839个，试验组与对照组相比差异代谢物有32个，其中17个上调，15个下调。在负离子模式下，共检测到1120个代谢物，试验组与对照组相比差异代谢物有20个，其中上调和下调代谢物分别为12个和8个。在负离子模式下，差异代谢物富集分析结果显示苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、多环芳烃降解、苯甲酸盐降解通路差异显著。结果表明，瘤胃微生物对棉酚的降解可能与其它芳香烃类物质相同。
试验二：棉酚降解菌的分离鉴定及其棉酚降解机制的研究
以棉酚作为唯一碳源的基础培养基筛选棉酚降解菌，同时结合传统生理生化与分子生物学方法鉴定分离得到的棉酚降解菌。结果显示，分离得到三株棉酚降解菌命名为GD2、GD5、GD8。三株棉酚降解菌在筛选培养基中菌落形态为圆形，白色，革兰氏染色为革兰氏阴性。16SrDNA鉴定结果显示三株棉酚降解菌分别为克雷伯氏菌菌属、肠杆菌属、考氏科萨克氏属，进一步检测棉酚与棉酚降解菌共培养72h后棉酚降解率，三株棉酚降解菌棉酚降解率分别可达31.67%、33.74%、18.33%。
运用RNA测序方法检测肠杆菌GD5转录基因的变化。结果显示，培养72h后，共检测得到132个差异基因，其中上调基因104个，下调基因28个。GO富集结果显示差异基因主要富集到生物过程和分子功能，其中显著影响了稳态过程。进一步分析发现添加棉酚组肠杆菌GD5细胞抗氧化应激相关基因表达显著上调。KEGG富集通路中棉酚显著影响了丙酮酸代谢。结果表明，棉酚诱导肠杆菌GD5氧化应激，导致肠杆菌GD5抗氧化应激基因表达显著上调，这可能是肠杆菌GD5耐受或是降解棉酚的原因。
运用LC-MS的方法检测添加棉酚后肠杆菌GD5培养液代谢物变化。结果显示，试验组与对照组相比在正离子模式下共检测到差异代谢物有9个，其中4个显著上调，5个显著下调。在负离子模式下，差异代谢物有6个，其中显著上调和下调代谢物分别为4个和2个。差异性代谢物通路富集结果显示，在正负离子模式下棉酚均影响了谷胱甘肽代谢，并且在负离子模式下差异性代谢物显著富集到了氨基酸生物合成过程。结果表明，肠杆菌GD5可能通过谷胱甘肽代谢起到棉酚降解作用。
综上所述，添加棉酚后对绵羊瘤胃液细菌、真菌、原虫优势属无显著影响，但对细胞骨架、细胞活性相关基因相对丰度和芳香烃类物质代谢有关的代谢物具有显著影响。体外试验证明，添加棉酚后诱导了肠杆菌GD5氧化应激，因此肠杆菌GD5抗氧化应激相关基因表达显著上调，代谢组学结果显示棉酚影响了细菌谷胱甘肽代谢，并且棉酚显著影响了肠杆菌GD5氨基酸的生物合成过程。本研究结果为开展瘤胃微生物耐受棉酚或生物降解棉酚的机制提供了重要科学资料。