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随着生活水平的提高,抗皱祛皱,靓丽肤色等延缓衰老的新需求日益增长。基质金属蛋白酶衰老学说和非酶糖基化衰老学说的问世很好地解释了皱纹和肤色暗黄形成的深层次原因,随着相应化妆品研究开发的急速增长,省时、简便、准确、高效的体外功效评价筛选方法亟待建立。本课题的研究主要包括两个方面:(一)体外抑制基质金属蛋白酶-1(Matrix Metalloproteinase-1, MMP-1)实验方法的建立1. MMP-1酶反应最佳实验条件研究采用单因素分析法确定MMP-1酶反应的最佳实验条件为:37℃下MMP-1酶原溶液(0.22μg/100μL)和酶原激活剂p-Aminophenylmercuric Acetate(APMA)溶液(30mmol/L)以10:1的体积比混合,恒温孵育45min,将MMP-1酶原激活,激活后的MMP-1溶液(0.20μg/100μL)与底物DQ-gelatin溶液(0.20μg/100μL)以体积比为1.0:1.3混合反应10min;采用荧光酶标仪法检测酶反应产物的荧光强度,确定最佳荧光检测条件为:激发波长460nm,发射波长520nm;2.体外抑制MMP-1实验方法的建立取活化后的MMP-1溶液(0.20μg/100μL)40μL加入96孔酶标板中,再加入某种待测植物功效成分溶液8μL,荧光底物DQ-gelatin溶液(0.20μg/100μL)52μL,37℃恒温孵育600s,在激发波长460 nm,发射波长520 nm条件下检测反应体系的荧光强度,扣除待测植物功效成分自身荧光强度后,与使用缓冲液代替植物功效成分的空白组对比,可得该植物功效成分对MMP-1的抑制率;3.运用体外抑制MMP-1实验方法对22种植物功效成分进行筛选,得到对MMP-1抑制率较高的四种植物功效成分(浓度均为50mg/mL)分别为:茶多酚(100.00%)、大黄提取物(100.00%)、马齿苋提取物(96.32%)和丁香酚(91.64%);4.以增稠剂AVC 1%,甘油1%,1,3-丁二醇2%(均为质量分数)作为配方基质,分别添加质量分数均为5%的大黄提取物、马齿苋提取物和丁香酚(因茶多酚不稳定,将其排除),形成三款啫喱状化妆品样品，对三款化妆品样品及空白基质对照样品进行为期28天的人体皮肤纹理度功效评价实验,皮肤粗糙度的相对降低率分别为:大黄提取物(-15.0%),马齿苋提取物(-14.0%),丁香酚(-14.0%),空白对照(-4.0%);5.人体皮肤纹理度功效评价实验结果与体外抑制MMP-1实验结果一致,证明体外抑制MMP-1实验方法可以用于抗皱祛皱化妆品功效添加剂的筛选与开发。(二)体外抑制非酶糖基化(Non-Enzymatic Glycation,NEG)实验方法的建立1. NEG最佳实验条件研究采用单因素分析法确定NEG最佳反应条件为:牛血清白蛋白与乙二醛质量比1.7:1.0,加叠氮化钠0.2%(质量分数),37℃恒温孵育72h;采用荧光分光光度法检测荧光产物的生成量,最佳荧光检测条件为:激发波长440nm,狭缝10nm,发射波长480nm,狭缝10nm,检测范围460-600nm;2.体外抑制NEG实验方法的建立在100mL PBS中逐次加入1.7g的乙二醛,1.0g的牛血清白蛋白和0.2g的叠氮化钠,依次溶解混匀形成反应液,取1.0mL反应液与1.0mL一定浓度的植物功效成分溶液混合,于37℃恒温避光孵育72h后在激发波长440nm,狭缝10nm,发射波长480nm,狭缝10nm,检测范围460-600nm的检测条件下测定产物的荧光强度,扣除待测植物功效成分自身荧光强度后,与使用缓冲液代替植物功效成分的空白组对比,可得该植物功效成分对NEG的抑制率;3.运用体外抑制NEG实验方法对13种植物功效成分进行筛选,得到对NEG抑制率较高的植物功效成分(浓度均为50mg/mL)为茶多酚(87%),马齿苋提取物(82%),厚朴提取物(76%);4.以增稠剂AVC 1%,甘油1%,1,3-丁二醇2%(均为质量分数)作为配方基质,分别添加质量分数均为5%的厚朴提取物和马齿苋提取物(因茶多酚不稳定,将其排除),形成两款啫喱状化妆品样品，对两款化妆品样品及空白基质对照组样品进行为期28天的人体皮肤色度LAB值功效评价实验,皮肤色度L值的提高率分别为:厚朴提取物(1.4%),马齿苋提取物(1.5%),空白对照(0.1%);皮肤色度B值的降低率分别为:厚朴提取物(-4.9%),马齿苋提取物(-5.4%),空白对照(-0.1%);5.人体皮肤色度LAB值测定实验结果与体外抑制NEG实验结果一致,证明体外抑制NEG实验方法可以用于去黄靓肤化妆品功效添加剂的筛选与开发。根据基质金属蛋白酶衰老学说和非酶糖基化衰老学说建立的两个体外功效检测实验为延缓衰老功效添加剂的筛选和开发提供了新方法,这两个方法可以用于筛选具有消除细纹、紧致肌肤、抗皱祛皱以及去黄靓肤、去除老年斑功效的添加剂,具有省时、简便、准确、高效等优点。