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褐飞虱是水稻生产上的重要害虫，已对多种杀虫剂产生抗性。因此，生产上急需开发出新型作用机理的杀虫剂用于其田间防治。硫激肽(Sulfakinin，SK)在调控昆虫取食中扮演重要角色，其通过结合硫激肽受体(Sulfakinin Receptor，SKR)来发挥作用，研究硫激肽及其受体组成的硫激肽信号(Sulfakinin signaling)通路可为新型杀虫剂作用靶标研发提供帮助。本研究中克隆了褐飞虱硫激肽及其受体基因全长序列，使用药理学和RNAi技术明确了硫激肽信号通路参与调节褐飞虱取食，并利用qPCR及免疫组织化学手段探究了褐飞虱硫激肽及其受体的表达模式。本研究主要研究内容如下:
一、褐飞虱硫激肽基因克隆与表达模式分析
通过已公布的褐飞虱基因组数据库，对褐飞虱硫激肽基因NSK进行克隆验证。NSK基因的开放阅读框长度为41lnt，位于scaffold123上，转录和翻译生成136个氨基酸最终经修饰加工成两种成熟肽，NSKⅠ(SDDYGHMRF)和NSKⅡ(GEADDKFDDYGHMRF)，特征结构预测结果表明，NSK的N端存在一个长度为27个氨基酸的信号肽结构，C端存在两个成熟肽前体胃泌素/胆囊收缩保守位点。使用昆虫及其他物种硫激肽成熟肽进行多重序列比对发现褐飞虱硫激肽具有昆虫保守的YGHM/LRF-NH2六肽结构。成熟肽的聚类进化分析显示褐飞虱硫激肽与其他节肢动物硫激肽聚为一类，具有较近的进化关系。通过荧光定量PCR的方法，对褐飞虱硫激肽基因进行表达模式分析。在褐飞虱不同发育阶段，NSK在卵期及1龄的低龄若虫阶段表达水平较高，之后随着龄期发育均出现逐渐降低的趋势，五龄虫期最低，成虫阶段表达量略高于五龄，雄虫体内的表达水平均高于雌虫。在褐飞虱成虫期不同组织中，硫激肽基因在褐飞虱脑组织中表达水平显著高于其他组织，脑组织中的表达量达到脂肪体和血淋巴的270倍。进一步使用免疫组织化学的方法，对NSK蛋白进行荧光标记，同样观察到NSK荧光信号在脑中的富集。比较了不同营养状况下褐飞虱脑中硫激肽表达量。研究结果显示饥饿24h后褐飞虱脑中硫激肽表达量显著降低，再次取食5h后恢复到正常水平，结果表明硫激肽可能与取食调节相关。
二、褐飞虱硫激肽调节取食的功能研究
根据已得到的褐飞虱NSK成熟肽序列，分别合成了硫激肽两种非硫酸化成熟肽(NSKⅠ∶SDDYGHMRF;NSKⅡ∶GEADDKFDDYGHMRF)和两种硫酸化成熟肽(sNSKⅠ∶SDD(sY)GHMRF;SNSKⅡ∶GEADDKFDD(sY)GHMRF)。将四种成熟肽溶解于生理盐水，通过显微注射的方法来明确NSK是否参与调控褐飞虱的取食行为，并比较了其与注射等体积生理盐水的对照组间取食量的差异。研究表明，注射NSK与对照相比取食量下降了40-80％不等，并且不影响褐飞虱的正常运动。根据NSK的基因序列合成NSK基因的双链RNA，通过显微注射递入NSK基因双链RNA至褐飞虱体内干扰NSK基因表达，利用qPCR和免疫组织化学检验干扰效率可以观察到转录水平和蛋白水平的表达量降低。取食测定表明，干扰硫激肽可以显著提升褐飞虱的取食量。
三、褐飞虱硫激肽受体基因克隆与功能研究
从硫激肽的分泌到抑制取食的产生，离不开硫激肽信号通路复杂的调控。硫激肽受体是硫激肽信号通路中关键的一环。根据公布的褐飞虱基因组数据库对褐飞虱硫激肽受体进行克隆验证。跨膜域预测结果表明，褐飞虱硫激肽受体具有G蛋白偶联受体(GPCRs)的典型特征，均存在7个跨膜域(TM1-TM7)、3个胞内环、3个胞外环、胞内C端和胞外N端。生物信息学分析表明，褐飞虱硫激肽受体也存在在其他昆虫硫激肽受体中被预测和证实的磷酸化位点、糖基化位点、棕榈酰化位点保守的结构域。通过RNAi方法进一步确认硫激肽及其受体是否是调节褐飞虱取食的关键因子。干扰硫激肽受体基因后，qPCR检测发现硫激肽受体基因在整头褐飞虱能被有效沉默。取食结果显示，注射硫激肽受体基因双链RNA3天后24h取食量高于对照80％，从而证明褐飞虱硫激肽及其受体基因在调节取食中发挥重要作用.
一、褐飞虱硫激肽基因克隆与表达模式分析
通过已公布的褐飞虱基因组数据库，对褐飞虱硫激肽基因NSK进行克隆验证。NSK基因的开放阅读框长度为41lnt，位于scaffold123上，转录和翻译生成136个氨基酸最终经修饰加工成两种成熟肽，NSKⅠ(SDDYGHMRF)和NSKⅡ(GEADDKFDDYGHMRF)，特征结构预测结果表明，NSK的N端存在一个长度为27个氨基酸的信号肽结构，C端存在两个成熟肽前体胃泌素/胆囊收缩保守位点。使用昆虫及其他物种硫激肽成熟肽进行多重序列比对发现褐飞虱硫激肽具有昆虫保守的YGHM/LRF-NH2六肽结构。成熟肽的聚类进化分析显示褐飞虱硫激肽与其他节肢动物硫激肽聚为一类，具有较近的进化关系。通过荧光定量PCR的方法，对褐飞虱硫激肽基因进行表达模式分析。在褐飞虱不同发育阶段，NSK在卵期及1龄的低龄若虫阶段表达水平较高，之后随着龄期发育均出现逐渐降低的趋势，五龄虫期最低，成虫阶段表达量略高于五龄，雄虫体内的表达水平均高于雌虫。在褐飞虱成虫期不同组织中，硫激肽基因在褐飞虱脑组织中表达水平显著高于其他组织，脑组织中的表达量达到脂肪体和血淋巴的270倍。进一步使用免疫组织化学的方法，对NSK蛋白进行荧光标记，同样观察到NSK荧光信号在脑中的富集。比较了不同营养状况下褐飞虱脑中硫激肽表达量。研究结果显示饥饿24h后褐飞虱脑中硫激肽表达量显著降低，再次取食5h后恢复到正常水平，结果表明硫激肽可能与取食调节相关。
二、褐飞虱硫激肽调节取食的功能研究
根据已得到的褐飞虱NSK成熟肽序列，分别合成了硫激肽两种非硫酸化成熟肽(NSKⅠ∶SDDYGHMRF;NSKⅡ∶GEADDKFDDYGHMRF)和两种硫酸化成熟肽(sNSKⅠ∶SDD(sY)GHMRF;SNSKⅡ∶GEADDKFDD(sY)GHMRF)。将四种成熟肽溶解于生理盐水，通过显微注射的方法来明确NSK是否参与调控褐飞虱的取食行为，并比较了其与注射等体积生理盐水的对照组间取食量的差异。研究表明，注射NSK与对照相比取食量下降了40-80％不等，并且不影响褐飞虱的正常运动。根据NSK的基因序列合成NSK基因的双链RNA，通过显微注射递入NSK基因双链RNA至褐飞虱体内干扰NSK基因表达，利用qPCR和免疫组织化学检验干扰效率可以观察到转录水平和蛋白水平的表达量降低。取食测定表明，干扰硫激肽可以显著提升褐飞虱的取食量。
三、褐飞虱硫激肽受体基因克隆与功能研究
从硫激肽的分泌到抑制取食的产生，离不开硫激肽信号通路复杂的调控。硫激肽受体是硫激肽信号通路中关键的一环。根据公布的褐飞虱基因组数据库对褐飞虱硫激肽受体进行克隆验证。跨膜域预测结果表明，褐飞虱硫激肽受体具有G蛋白偶联受体(GPCRs)的典型特征，均存在7个跨膜域(TM1-TM7)、3个胞内环、3个胞外环、胞内C端和胞外N端。生物信息学分析表明，褐飞虱硫激肽受体也存在在其他昆虫硫激肽受体中被预测和证实的磷酸化位点、糖基化位点、棕榈酰化位点保守的结构域。通过RNAi方法进一步确认硫激肽及其受体是否是调节褐飞虱取食的关键因子。干扰硫激肽受体基因后，qPCR检测发现硫激肽受体基因在整头褐飞虱能被有效沉默。取食结果显示，注射硫激肽受体基因双链RNA3天后24h取食量高于对照80％，从而证明褐飞虱硫激肽及其受体基因在调节取食中发挥重要作用.