前言多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,简称PCOS),是一种常见的妇科内分泌疾病,以持续不排卵和高雄激素为主要特征,其发生率占育龄妇女的5～10%,占不排卵妇女的75～80%。PCOS的统一诊断标准始见于1935年,Stein和Leventhal描述为闭经、多毛和双侧卵巢多囊性增大的无排卵相关综合征。1990年美国国家健康委员会(National Institute of Health, NIH)会议规定其诊断标准为“临床或生化有高雄激素表现,持续无排卵和除外其他疾病”。但经多年临床观察发现,大部分PCOS患者超声有卵巢多囊性改变。因此,关于这个诊断标准一直存在争议。2003年在荷兰鹿特丹(Rotterdam)定义了PCOS新的诊断标准,把卵巢的形态学改变“多囊性卵巢”作为其诊断标准之一。鹿特丹诊断标准:(1)排卵少或不排卵;(2)有高雄激素血症的临床和生化特征;(3)超声检查有多囊性卵巢。排除其它雄激素过高相关疾病。2006年雄激素过高协会(Androgen Excess Society,AES)标准认为:(1)多毛及/或高雄激素血症;(2)稀发排卵或无排卵及/或多囊卵巢;(3)排除其它雄激素过高相关疾病,如先天性肾上腺增生症(Congenital adrenal hyperplasia,CAH)、柯兴氏征、高泌乳素血症、严重的胰岛素抵抗综合征、分泌雄激素的肿瘤、甲状腺功能异常等。此外还有与PCOS相关的体征和症状:生殖内分泌方面,有(1)LH分泌过高;(2)肾上腺雄激素分泌过高;(3)卵巢对促性腺激素刺激反应性过高;(4)高流产率;(5)子宫内膜增生和子宫内膜癌;(6)妊娠期糖尿病,等。代谢方面,有(1)胰岛素抵抗及高胰岛素血症;(2)葡萄糖耐量降低;(3)II型糖尿病;(4)肥胖;(5)胰腺对葡萄糖反应受损;(6)高脂血症,等。此外心血管疾病、睡眠呼吸暂停综合征、痤疮、慢性炎症的发病率增加。但目前其发病原因仍不清楚,现多数学者认为:可能是一种遗传因素和环境因素共同决定的多因素异质性疾病,治疗方面只能治标不能治本,需要药物维持才能缓解症状。因此,进一步探讨其病因及发病机制对PCOS的治疗有极大的推动作用。然而,对人体进行PCOS研究存在局限性,尤其是在发病机制方面,因此对相应模型动物的研究也成为一种必需,所建立的模型如外源性雄激素所造模型、雌激素所造模型、持续光照所造模型,尽管均能够从不同侧面反映PCOS,但是不能够全面反映PCOS内分泌改变及局部性腺病理改变,也不能够充分说明其发病原因。为了解决上述矛盾,科学家作了大量研究,研究者发现:胎儿时期,身体各组织和器官都会经历发育的敏感阶段,此敏感阶段可能与细胞的快速分裂相关。如果在这个敏感阶段受到某种刺激或损伤,将会导致终生的影响。最近对动物研究表明,PCOS可能与此有关。可能是由于在妊娠胎儿期,循环雄激素过高刺激下,对胎儿生殖腺等产生影响,导致成年后PCOS的发生。Abbott等对猴的研究已证实,妊娠期暴露过高雄激素的雌性恒河猴,成年后的体征和症状与PCOS患者相似,第一次对PCOS发生起源进行了观察,证实了PCOS的“成人疾病胎源说”观点。由于上述原因,本课题选择Sprague—Dawley(SD)大鼠(正常妊娠周期为21～22天)进行实验,对此大鼠于妊娠期16～19天每日皮下注射睾酮(Testosterone,T)或者双氢睾酮(Dihydrotestostrone,DHT)4mg,注药剂量选择参考了以前有关研究者关于SD大鼠下丘脑研究的相关文献资料。此注射时间和剂量选择依据:在妊娠过程中给予此雄激素剂量能够部分雄性化肛门-生殖器距离和性行为。本研究以期其症状与体征与PCOS患者更加相似,并在此基础上,对PCOS的发病机制及原因进行更深入的分析探究。目的PCOS发病原因未明,进一步探讨其病因及发病机制对PCOS的诊断治疗有极大的推动作用。然而,对人进行发病机制方面的研究尚有局限性,如不能切除卵巢,不能获得下丘脑等性腺轴标本等等。而且,目前许多动物模型也仅仅从不同侧面反映PCOS的相关体征和症状,未进一步从分子生物学水平探讨其发病原因。由于上述原因,本课题使用SD大鼠妊娠期给予雄激素即模拟妊娠期过高雄激素状态,观察雄激素对动物的影响,并在此基础上,对PCOS的原因进行深入的分析探究。具体为:1. SD大鼠在妊娠期16～19天每日皮下注射T或者DHT4mg构造出妊娠期雄激素过高大鼠。对妊娠期雄激素过高和对照组SD大鼠卵巢切除后进行苯甲酸雌二醇(Estradiol benzoate,EB)刺激,分析孕酮受体(Progesterone Receptor,PgR)mRNA的表达水平,从分子生物学方面了解妊娠期雄激素过高大鼠下丘脑的变化情况。2.观察各组出生后雌性小鼠外生殖器的变化,了解妊娠期雄激素过高对雌鼠外生殖器的影响。3.观察妊娠期雄激素过高雌性大鼠动情周期及激素分泌方式的改变情况,与PCOS患者内分泌及月经周期变化的相似性进行比较。4.对妊娠期雄激素过高及正常雌性大鼠的代谢特征进行研究,了解各组大鼠代谢特征的变化。方法1.大鼠以4:1或3:1雌雄比例合笼,出现阴道栓为妊娠第1天。后在妊娠16～19天实验组皮下注射上述睾酮或双氢睾酮4mg+0.2ml注射用油,空白组注射0.2ml注射用油,出生后81日(SD大鼠60日后处于成年期,生理结构发育完善)上午11:00～11:30对照组在动情间期手术切除卵巢,实验组在相同时间进行同样处理,然后迅速注射苯甲酸雌二醇(Estradiol benzoate,EB)30μg,第二天中午12点迅速断头处死大鼠,取出的下丘脑视前区(Preoptic area,POA),迅速放入液氮中保存。然后进行RT-PCR实验,分析其PgR mRNA表达情况,从分子生物学方面了解妊娠期雄激素对成年后下丘脑的影响。2.给药方式同上,小鼠在出生后第2日、第22日、第60日(Postnatal day 2,PND2;同样,PND22,PND60),测量肛门生殖器距离(Anogenital distance,AGD);第13日检查乳头情况。3.给药方式同上。(1)60～70日时,上午11:00～11:30对照组仔鼠在动情间期,实验组在相同日期(无阴道,不能进行阴道涂片),戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg,ip),无菌注射器下腔静脉采血,制备的血清观察激素(E2,P,T,LH)分泌变化。(2)对照组在动情间期,实验组在同一时间手术切除卵巢,第7天12:00～15:00,每10分钟眼眶静脉取血一次共3小时,血清进行LH放免测定,了解LH分泌的频率和振幅变化。4.在出生后小鼠70日的晚上8时开始禁食,次日上午8时按3g葡萄糖/kg体重的剂量灌服50 %葡萄糖液,灌糖后分别在0、30、60、120min鼠尾尖取血,采用血糖仪检测血糖,放免检测法胰岛素。结果1.卵巢切除后EB刺激,其PgR mRNA表达情况比较:各组老鼠卵巢切除后,EB刺激,对照组PgRmRNA(1.2112±0.2355)表达量高于实验T组(0.5017±0.3234)和DHT组(0.4123±0.2876),均P<0.05。2. (1)出生后各组仔鼠AGD。对照组与实验T组、DHT组间分别比较:PND2(依次为:1.4±0.1 vs 1.6±0.1,1.4±0.1 vs 1.7±0.1,均P<0.01);PND22(依次为10.5±0.4 vs 14.2±1.1,10.5±0.4 vs 14.9±0.5,均P<0.01);PND60(依次为15.1±0.5 vs 19.1±0.4,15.1±0.5 vs 19.0±0.3,均P<0.01)。但实验组间比较:PND2(依次为:1.6±0.1 vs 1.7±0.1, P>0.05);PND22(依次为14.2±1.1 vs 14.9±0.5, P>0.05);PND60(依次为19.1±0.4 vs 19.0±0.3, P>0.05)。(2)出生后各组仔鼠PND13乳晕检查。对照组与实验T组、DHT组间比较:正常乳晕数(11.9±0.3 vs 1.5±0.5,11.9±0.3 vs 1.3±0.5,均P<0.05)。实验组间(1.5±0.5 vs 1.3±0.5,P>0.05)。总乳晕数(12±0.0 vs 2.8±0.8,12±0.0 vs 2.4±0.7, P<0.05);实验组间(2.8±0.8 vs 2.4±0.7,P>0.05)。3. (1)激素测定结果。对照组分别与实验组(T组,DHT组)比较:依次分别为E2(15.3±0.5 vs 23.0±1.2,15.3±0.5 vs 23.0±1.2,P<0.05)(ng/ml);P(15.3±0.7 vs 24.7±0.6,15.3±0.7 vs 24.7±2.1, P<0.05)(ng/ml);LH(0.44±0.07 vs 0.77±0.07,0.44±0.07 vs 0.76±0.07,P<0.05)(ng/ml),三种激素比较均有统计学意义。T(0.019±0.007 vs 0.021±0.008,0.019±0.007 vs 0.024±0.008,P>0.05)(ng/ml),对照组与实验组T水平比较均无统计学意义。实验组间各组激素对应比较,均P>0.05,无统计学意义。(2)各组大鼠LH分泌频率和幅度测定。观察发现:实验T组大鼠与对照组相比,频率增加,幅度更大;但实验DHA组由于实验原因没有得出类似结果。4.妊娠期雄激素过高及正常组大鼠OGTT结果比较。三组空腹血糖分别为(4.4±0.2 vs 4.4±0.3,4.4±0.2 vs 4.3±0.2,P>0.05)(mmol/L);1h血糖(7.43±0.21 vs 7.45±0.22,7.43±0.21 vs 7.31±0.34,P>0.05)(mmol/L);2h血糖(6.18±0.14 vs 6.18±0.14,6.18±0.14 vs 6.06±0.20,P>0.05)(mmol/L)。三组空腹胰岛素分别为(13.9±1.0 vs 14.2±0.6,13.9±1.0 vs 14.2±1.0,P>0.05)(mU/L);2h胰岛素(12.0±0.7 vs 11.5±0.8,12.0±0.7 vs 11.9±1.0,P>0.05)(mU/L)。结论1.正常雌鼠E2给予能够诱导PgR mRNA的表达产生LH峰,妊娠期雄激素过高大鼠(T组和DHT组)E2给予诱导产生PgR mRNA减少,PgR mRNA分泌的减少进而导致下丘脑分泌GnRH减少,从而不产生LH峰。与PCOS患者LH分泌异常、稀发排卵或不排卵症状一致,这抑或是PCOS排卵障碍的原因之一。2.妊娠期雄激素过高大鼠AGD明显增加,乳头数明显减少,出现假两性畸形。与人类有关疾病发生相似,如孕期使用雄激素及合成的孕激素:可致女性假两性畸形。但PCOS患者很少出现有外生殖器雄性化改变。分析原因:由于晚成雏哺乳动物,如SD大鼠,出生时外生殖器和神经系统处于分化发育中期,出生前后几天时间内生殖器对雄激素反应敏感,因此这类哺乳动物,在妊娠晚期暴露过多雄激素,生殖器雄性化;而人类,雄激素对生殖器的雄性化作用的敏感时间仅持续到妊娠中期。3.妊娠期雄激素过高大鼠:表现出LH分泌量和频率均增加,动情周期改变(周期延长)。与PCOS患者月经失调症状,以及LH/FSH比值高相似,推测可能与PCOS患者妊娠期雄激素过高有关。4.妊娠期雄激素过高大鼠糖代谢变化无异常,而PCOS患者糖耐量降低,糖尿病风险增高,推测可能与物种不同有关。