L-谷氨酰胺高产菌株的选育及其发酵过程的优化

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L-谷氨酰胺(L-Glutamine,简称Gin)是由L-谷氨酸的γ-羧基酰胺化的一种条件必须氨基酸,它是一种重要的营养物质,也是一种极有发展前途的新药,在临床上主要用于治疗脑神经疾病及消化道溃疡。世界上生产谷氨酰胺的主要生产国是日本,韩国也有少量生产,均采用发酵法。1997年日本开始发酵生法生产,到20世纪90年代中期其发酵水平达到60g/L,韩国的发酵水平为50g/L。目前,我国的药用谷氨酰胺尚属空白,采用发酵生产的厂家也几乎没有。生产谷氨酰胺的前提是要有谷氨酰胺高产菌株。为此,我们进行了高产菌株的定向选育研究及其发酵条件的优化研究。 谷氨酰胺的生物合成是以谷氨酸为前体物质,在谷胺酰胺合成酶的催化下酰胺化生成。所以,谷氨酰胺高产的前提是谷氨酸高产。我们首先以一株谷氨酸高产的谷氨酸棒状杆菌(CorynebacteriumglutamicumA-26)为出发菌株,先后采用亚硝基胍(NTG),紫外线等进行诱变,并选用谷氨酰胺的两种结构类似物磺胺胍(SG)、甲硫氨酸亚砜(MSO)以及硫酸铵((NH4)2SO4)筛选出具有三重抗性标记的谷氨酰胺高产菌株C.glutamicumN-U-6,其谷氨酰胺最高产量可达33.54g/L,比出发菌株的产量(15.64g/L)高出1.14倍。并检验了其具有较好的遗传稳定性。 然后对其发酵培养条件进行了优化。首先采用单次单因子非统计优化技术确定了它在250mL的摇瓶培养条件为:最佳碳源为150g/L葡萄糖,最佳无机氮源及其浓度为:40g/LNH4Cl;最佳有机氮源及其浓度:14g/L尿素;玉米浆浓度:1g/L,初始pH为7.2,培养温度为30℃,接种量为10%,种龄为12h,装液量为30ml。谷氨酰胺产量达到37.21g/L,比优化前的突变株提高10.9%。 之后,利用Placktt-Burman法从葡萄糖、尿素、NH4Cl、MnSO4、FeSO4和ZnSO4的浓度七个因子中筛选出尿素、NH4Cl和ZnSO4的浓度三个对产胺的影响较大的重要因子。接着采用响应面法确定了它们的最佳值,并结合初步优化结果,得到了一个比较适合突变菌株C.glutamicumN-U-6进行谷氨酰胺合成的发酵培养条件为(g/L):葡萄糖150,玉米浆10,尿素12.7,NH4Cl23.6,KH2PO40.5,K2HPO40.5,MgSO405,FeSO40.02,MnSO40.025,ZnSO40.004,初始pH7.2。CglutamicumN-U-6在优化后的培养条件下最高产量达39.53g/L,比优化前的33.54g/L提高17.86%。 最后对C.glutamicumN-U-6进行了5-L发酵罐的发酵实验。在采用搅拌速率为850rpm和通气量为1.5VVM的条件下,在发酵中后期流加30%的尿素达到控制pH维持6.2,同时达到补充氮源的双重目的,进一步提高了产量,最高达56.67g/L,发酵周期缩短到44小时。我们还进行了氮饥饿处理的实验:初期脲量减少为原来的60%,后期补加尿素以补充氮源同时也起到控制pH的作用,谷氨酰胺的产量达到62.52g/L,比氮饥饿处理前(56.67g/L)提高了约6%,其发酵周期缩短到40小时。
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