人血小板生成素（thrombopoietin，TPO）是体内调节血小板生成的首要调节因子，它可以特异性提高体内血小板的水平，预防和治疗由于放化疗引起的血小板减少症及原发性血小板减少性紫癜。最新研究还发现，TPO作为一种细胞调节因子可以促进造血干细胞的增长。本研究的最终目的和意义是：为了制备乳汁中高效表达人血小板生成素的转基因克隆牛，构建不同启动子引导的TPO真核表达载体，使其在乳腺特异表达，并分别在细胞水平和个体水平检测TPO表达量，同时为TPO及启动子等基因表达调控提供科学数据。研究和实验方法：构建三个乳腺特异表达载体pB3.9T、pB1.9T和pPT，通过瞬间转染及稳定整合后，在转录及翻译水平检测TPO表达。 结果显示，首先，本实验选用的长约1.3kb的TPO minigene经转录后可以正确地剪切，并翻译合成人TPO。其次，BLG3.9、BLG1.9和P1A3三种调控元件都可以启动人TPO在乳腺细胞中特异表达。第三，pB3.9T表达量要明显高于pB1.9T。第四，当表达载体稳定整合入细胞基因组，TPO表达量呈稳步上升趋势，并且要高于瞬时转染的表达量。第五，在瞬时转染及稳定转染早期，P1A3启动子调控的TPO真核表达载体的表达水平要明显高于BLG3.9和BLG1.9启动子调控的TPO真核表达载体。但随着时间推移，细胞数目不断地增加，pB3.9T却远远超过了pPT。第六，获得稳定整合了三种载体的单克隆成纤维细胞系。 我们可以得出以下结论，第一，山羊β-乳球蛋白基因和β-酪蛋白启动子都能够指导TPO在乳腺细胞中特异表达。第二，在BLG基因5’端启动子上游-3.9kb至 -1.9kb 区域内可能含有特殊的增强序列。第三，随着细胞的不断增值，BLG3.9启动子可能激活了某种增强机制，或削弱了某种抑制机制。第四，证实了BLG转录子去阻遏和激活调节转变机制的存在，初步推论极有可能在BLG基因5’端上游-3.9kb至-1.9kb之间存在这一调节区域。第五，本研究构建的三个载体均可以用来制备转基因动物，并且可以为克隆牛提供转基因核供体细胞系。