链霉菌噬菌体ΦC31位点特异性整合酶在不需要任何辅助因子的情况下可将带有attB的外源核苷酸序列位点特异高效的整合到哺乳动物细胞基因组的假attP位点上,因而,该整合酶系统已成为在哺乳动物细胞中进行转基因位点特异性重组操作和基因治疗的有用工具。然而,该整合酶系统在哺乳动物细胞上介导整合的位点特异性和整合效率仍需进一步提高。而解析ΦC31位点特异性整合酶结构与功能的关系是解决上述问题的基础和关键。为此,本文拟基于生物信息学预测,分别从保守位点大规模突变和锌指结构解析两方面来研究ΦC31位点特异性整合酶结构和功能的关系。第一部分,我们利用生物信息学对ΦC31位点特异性整合酶和大丝氨酸整合酶家族成员进行氨基酸同源序列比对,结果显示,ΦC31位点特异性整合酶存在62个氨基酸保守位点。为了研究这些氨基酸保守位点的功能,我们将其中19个保守位点进行定点突变,一共得到17个ΦC31位点特异性整合酶突变体。体内和体外重组活性试验检测,发现其中有11个突变体（R18A、I141A、L143A、E153A、G182A/F183A、C374A、C376A/G377A、Y393A、I432A、V566A和V571A）重组活性降低甚至消失。为了探讨这11个突变体重组活性降低甚至消失是否与其DNA结合能力降低有关,我们利用EMSA检测了这些突变体与attB或attP形成蛋白-DNA复合体的能力；结果显示,与野生型相比6个突变体（R18A、I141A、L143A、E153A、I432A和V571A）的DNA结合能力大大降低,5个突变体（G182A/F183A、C374A、C376A/G377A、Y393A和V566A）完全失去了与特异靶DNA attB序列结合的能力。为了探讨具有较低DNA结合能力的突变体重组活性降低甚至消失是否与该酶的联会能力和DNA剪接能力降低有关,我们利用EMSA检测了5个突变体（R18A、I141A、L143A、E153A和I432A）与attB和attP形成蛋白-DNA联会复合体的能力和剪接attB和attP形成attL和attR的能力；结果显示,这些突变体保留了不同程度的联会能力,但R18A、I141A、 L143A和E153A被阻滞在重组过程中的链剪切阶段,而I432A重组得到不正常的剪接产物。为了探讨完全丧失DNA结合能力突变体是否由于其二级结构改变导致DNA结合能力的缺陷,我们利用圆二色谱检测了6个突变体（G182A/F183A、C374A、C376A/G377A、Y393A、V566A和V571A）的二级结构组成；结果显示,与野生型相比突变体C374A和C376A/G377A在二级结构上改变不大,突变体G182A/F183A, Y393A, V566A和V571A在p-折叠和转角比例上变化巨大,提示这些残基的突变影响到蛋白通过β-折叠形成发卡结构。该部分结果提示ΦC31位点特异性整合酶的N端和C端某些高度保守的残基在底物结合和剪接中起到重要作用。ΦC31位点特异性整合酶C端中的半胱氨酸丰富区和亮氨酸、缬氨酸丰富区可能代表了整合酶主要的DNA结合区域。第二部分,我们利用生物信息学将ΦC31位点特异性整合酶与大丝氨酸家族进行二级结构预测,结果显示ΦC31位点特异性整合酶存在一个主要由C374、C376、C395和C413这四个半胱氨酸与锌原子结合而形成的锌指结构域。为了验证ΦC31位点特异性整合酶锌指结构的存在,我们将这些半胱氨酸通过定点突变得到C374A、C376A、C395A和C413A四个突变体。通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析,发现每摩尔野生型ΦC31位点特异性整合酶含0.99摩尔锌原子,而每摩尔C374A、C376A、C395A和C413A锌原子含量大大降低,低于0.4摩尔；提示了ΦC31位点特异性整合酶存在一个由C374、C376、 C395和C413这四个半胱氨酸与锌结合构成的锌指结构域。为了探讨ΦC31位点特异性整合酶锌指结构域中半胱氨酸对ΦC31位点特异性整合酶构象稳定性的影响,我们对野生型ΦC31位点特异性整合酶及半胱氨酸突变体进行了限制性蛋白酶解试验；结果显示,C374,C376和C395的突变使ΦC31位点特异性整合酶更容易被胰蛋白酶降解,说明突变体C374A、C376A和C395A蛋白构象不如野生型稳定。为了检测ΦC31位点特异性整合酶锌指结构域对其重组功能的影响,我们利用了体内重组检测系统检测ΦC31位点特异性整合酶及其半胱氨酸突变体在大肠杆菌体内的重组活性；结果显示,半胱氨酸突变体C374A、C376A和C395A重组活性完全消失,半胱氨酸突变体C413A重组活性下降到40.4%；提示锌指结构的破坏影响到ΦC31位点特异性整合酶的重组活性。为了探讨ΦC31位点特异性整合酶锌指结构域中半胱氨酸的突变引起ΦC31位点特异性整合酶重组活性的丧失或降低的原因是否由于锌指结构被破坏影响到DNA结合能力,我们检测ΦC31位点特异性整合酶与其底物序列attB或attP产生蛋白-DNA复合体的能力；结果显示,在检测范围内C374、C376和C395的突变使ΦC31位点特异性整合酶结合底物序列attB的能力消失,结合attP的能力大大降低,C413的突变使整合酶DNA结合能力稍微降低,这说明ΦC31位点特异性整合酶实现DNA重组的过程中锌指结构域起到识别结合DNA的作用。为了探讨锌指结构域中碱性氨基酸丰富区在ΦC31位点特异性整合酶中的作用,我们构建了1个碱性氨基酸丰富区缺失突变体（ΦC31（△383-399））和7个碱性氨基酸点突变体（R384A、K390A、R394A、R396A、R397A、R398A和R399A）,利用EMSA和ΦC31位点特异性整合酶体内重组活性检测系统检测了这8个突变体的DNA结合能力及体内重组活性能力,结果显示,碱性氨基酸丰富区的突变影响到ΦC31位点特异性整合酶DNA结合能力和重组能力,提示ΦC31位点特异性整合酶可能通过锌指结构中的碱性氨基酸来识别attB和attP中的特异序列。为了探讨attP中的"E-box类似序列”在与ΦC31位点特异性整合酶结合中的作用,我们将attP突变得到attP-Emut序列,EMSA检测ΦC31位点特异性整合酶与attP-Emut的结合情况,结果显示,attP-Emut不能与ΦC31位点特异性整合酶结合,提示attP中E-box类似序列’CAACTG"和"CAGTTG’’在与ΦC31位点特异性整合酶结合中起重要作用,可能是ΦC31位点特异性整合酶锌指结构中碱性氨基酸丰富区直接特异识别的位点。总之,本研究在生物信息学结构预测的基础上,利用生物学技术和方法通过对ΦC31位点特异性整合酶保守位点大规模突变及锌指结构的研究,证实了ΦC31位点特异性整合酶某些高度保守残基与DNA结合、联会和剪接能力相关,提示了这些不论在N端或C端的保守性残基对DNA重组起重要作用；进一步证实了ΦC31位点特异性整合酶锌指结构的存在,提示了锌指结构在ΦC31位点特异性整合酶中起到特异结合DNA的主要作用。这些发现对于进一步了解ΦC31位点特异性整合酶的结构和功能信息,尤其是将为研发出具有更高整合特异性及效率的ΦC31位点特异性整合酶系统并使其在基因功能和基因治疗研究中广泛应用奠定基础。