猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）所导致的急性、高度传染性和严重致死性的肠道系统疾病。自英国于上世纪70年代首次发现PED以来,该病广泛蔓延于世界各地,对全球养殖业和农牧民造成了难以弥补的经济损失。追溯到本世纪初期,在PEDV疫苗的成功开发及广泛应用下,该病防治效果显著。2010年PED在我国多地风暴流行,基于经典毒株CV777和DR13制备的疫苗无法对仔猪起到有效的免疫保护作用,这一现象提示大家PED的暴发可能是由于PEDV进化和变异为不同的基因型引起的,所以对于多样化的PEDV毒株,传统疫苗无法保护仔猪免受感染。市场中现存的针对PEDV的疫苗普遍通过肠外方式接种,无法有效诱导高滴度的特异性血清IgG抗体和黏膜SIgA抗体,导致对PEDV感染的黏膜保护作用不佳,因此开发出能够在肠道内提供足够的黏膜保护的PEDV疫苗和免疫策略势在必行。目的:（1）分析市场现有PEDV疫苗不足以提供有效保护作用的原因;（2）分析确认可作为针对PEDV亚单位疫苗的抗原基因,摸索通过原核表达系统获得该重组蛋白的诱导表达条件和纯化方法,为PEDV亚单位疫苗的制备奠定基础;（3）评价PEDV COE亚单位疫苗的免疫原性,初步研究PEDV亚单位疫苗的免疫策略,探讨其在PEDV相关疫苗研发中的潜在价值。方法:（1）分析自2010年以后国内PEDV流行株COE（499 aa～638 aa）氨基酸序列同源性,通过全基因合成方法获得其中相对保守毒株的COE基因序列;（2）利用生物信息学工具分析COE基因的基本特点、二级结构和抗原表位等信息;（3）使用p ET32a（+）原核表达系统表达重组COE蛋白并纯化;（4）以纯化后的重组COE蛋白免疫仔猪,收集各时间段血清和黏膜样品,建立重组COE蛋白抗原检测PEDV特异性抗体的间接ELISA方法,检测免疫前后血清中特异性IgG抗体、粪便和唾液黏膜组织中特异性SIgA抗体以及细胞因子水平变化,通过体液免疫和细胞免疫综合评价猪流行性腹泻病毒COE亚单位疫苗的免疫原性。结果:（1）分析比对近年来国内PEDV流行株COE氨基酸序列同源性,选取相对保守毒株CH/PDS/2015（Gen Bank登录号:KU237224,中国河南）作为模板,成功合成了COE基因。生物信息学分析结果表明,截取的COE蛋白（499 aa～638 aa）不存在信号肽和跨膜结构域,空间结构相对紧密。B细胞抗原表位预测结果显示,COE蛋白含有丰富的B细胞抗原表位,有望成为亚单位疫苗的候选靶标。（2）构建pcDNA3.1-COE真核重组质粒,并检测到该重组质粒在基因水平成功表达。构建重组原核表达菌株pET-32a-COE-Trans B（DE3）,大小约为35 k Da的重组COE蛋白以包涵体形式表达,纯化效果良好,成功制备了PEDV COE亚单位疫苗,并建立了COE亚单位疫苗的制备方法。（3）重组COE蛋白与CpG-ODN+Curdlan通过肌肉注射免疫方式可刺激仔猪血清中特异性IgG显著升高（p<0.001）,且长期维持在较高水平。口服途径免疫后在粪便和唾液样品中检测到了低水平且短暂的特异性SIgA抗体。结论:PEDV COE亚单位疫苗具备良好的免疫原性,可刺激机体产生高水平的特异性抗体;抗原与CpG-ODN+Curdlan联合使用的肌内抗原注射（初次免疫）和随后口服抗原（加强免疫）的新型免疫策略,为猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗的免疫推广奠定了理论基础,为猪流行性腹泻病的防治提供新思路。有关PEDV COE亚单位疫苗诱导机体高水平且持久的黏膜免疫策略仍然有待深入研究。