昆虫是自然界中种类最多的动物种群,许多昆虫都能分泌生物粘合剂来保护自身、巢穴或者它们的卵。昆虫分泌的生物粘合剂具有很好的粘合性能,常常能够在潮湿、肮脏的环境中保持长久的粘性。家蚕作为鳞翅目的代表昆虫,多个组织器官能分泌具有粘性作用的物质,比如丝腺和粘液腺。粘液腺是家蚕雌性生殖系统的一个附属器官,在蛹前期发育缓慢,但在蛹羽化前发育迅速,并且合成大量的粘液,在产卵时涂布于卵的背面,用于将卵锚定在桑叶或蚕种纸上。许多研究关注于昆虫的粘液腺形态和粘液理化特性,发现粘液的主要成分是卵胶蛋白（Egg glue protein,EGP）,并且发现这些卵胶蛋白都普遍富含甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸等氨基酸。尽管如此,至今尚未有文献报道昆虫粘液腺分泌的卵胶蛋白的序列。因此,是什么样的结构赋予了卵胶蛋白优良的粘性仍未可知。本研究围绕这些问题进行了深入研究。本研究对家蚕雌蛾的粘液腺进行了转录组测序,筛选到了在粘液腺中表达量较高的基因,利用LC-MS/MS对粘液中最明显的条带进行质谱分析,鉴定到了一个候选的卵胶蛋白,通过5’和3’RACE获得了完整的卵胶蛋白编码基因,并对其进行了序列结构分析、糖基化分析以及粘合性能研究。获得的主要结果如下:1.家蚕卵胶蛋白EGP的鉴定及表达特征分析通过体视显微镜与电镜对家蚕卵腹面进行观察发现,卵的腹面有一层透明胶状薄膜,这层薄膜是由粘液腺分泌的粘性物质风干后形成的。为了鉴定到发挥粘性功能的蛋白,我们使用尿素对卵面进行洗脱,进行SDS-PAGE,结果显示,卵面洗脱蛋白含量较为丰富,主条带位于280 k Da。通过对主条带挖胶质谱鉴定以及对家蚕雌性成虫粘液腺进行转录组分析,鉴定到同一基因,将其基因序列在Silk Base数据库中进行检索,鉴定到其为未知功能蛋白,但基因序列并不完整。因此,我们采用5’RACE的方法获得了完整的基因序列,我们将其名命为卵胶蛋白（egg glue protein）。卵胶蛋白共有2163个氨基酸,第一个外显子编码的23个氨基酸MDPKHYGVLAVLLLSTFIFWVDG预测为卵胶蛋白的信号肽。第19外显子为短序列高度重复区,以5个氨基酸为一重复单元,共重复了346次,重复最多的重复单元为GGNQQ,其中第1位和第2位的Gly非常保守,第3位的Asn和第4位的Gln有时会被酸性残基Glu和Asp或碱性残基Lys取代,而Pro偶尔会代替Gln出现在第5位。第21号外显子中有两个半胱氨酸,通过电泳发现,卵胶蛋白能够形成二硫键。对卵胶蛋白进行时期表达谱进行分析,发现卵胶蛋白仅在雌性成虫的粘液腺特异高量表达,进一步研究发现卵胶蛋白主要是在粘液腺的分泌部合成。对雌性从蛹期到蛾期的组织表达谱进行分析,发现卵胶蛋白在蛹3天开始表达,表达量随着蛹的发育逐步上升,在雌蛾羽化当天达到最高值,在羽化后逐步下降。利用免疫荧光定位的方法观察卵胶蛋白在粘液腺的贮藏部和分泌部的分布情况,发现卵胶蛋白是由呈树枝状的分泌部合成并分泌到管腔,然后再流动到体积膨大的贮藏部官腔内贮存。2.家蚕卵胶蛋白EGP的真核表达、纯化及结构分析仔细分析家蚕卵胶基因的基因序列发现,序列结构主要由信号肽、N端、重复区、C端四部分组成,重复区主要是由肽GGNQQ高度重复组成,共重复346次,重复区具有重复性高、重复单元小的特点;为探究重复区对卵胶蛋白结构和功能的影响,通过真核细胞表达和原核细胞表达的方法对重复区序列截取片段进行蛋白表达,原核细胞表达和真核细胞表达的重组卵胶蛋白经镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化,获得大量纯重组卵胶蛋白,经液相色谱-串联质谱法鉴定为所需靶蛋白,Western blot结果也表明His抗体均能识别带有His标签的原核和真核表达的重组卵胶蛋白;为了探究其重复区对卵胶蛋白结构的影响,通过圆二色谱探究其结构特征,结果显示,高蛋白浓度能够促进卵胶蛋白由无规卷曲向α-螺旋最终形成β-turn结构。重组卵胶蛋白在不同温度和不同酸碱度下结构都非常稳定,并且随着热量的升高也能增加β-turn结构的含量。红外光谱显示,真核表达重组卵胶蛋白中β-turn含量更高,高蛋白浓度或高温有利于卵胶蛋白的构象由不规则结构向β-turn转变。β-turn的串联能够形成β-螺旋的有序状态构象,被认为是具有高度弹性的结构,也是卵胶蛋白具有粘合性能的重要原因之一。3.家蚕卵胶蛋白EGP粘附性能分析我们对原核表达和真核表达体系表达的重复区蛋白和卵面洗脱的蛋白进行糖染色,发现从卵面提取的卵胶蛋白和真核表达的卵胶蛋白能被席夫碱染成红色条带,表明天然的卵胶蛋白和真核表达的重组卵胶蛋白都具有糖基化修饰。通过对天然卵胶蛋白进行LC-MS/MS质谱鉴定,检测了卵胶蛋白糖基化修饰位点及类型,发现天然卵胶蛋白含有N-糖基化修饰和大量O-糖基化修饰,这与粘性蛋白特性十分吻合。为了探究家蚕卵胶蛋白卵胶蛋白粘附性能与及粘附机理,我们对真核和原核表达重组卵胶蛋白通过万能拉伸仪进行粘结强度检测,发现拥有糖基化修饰的真核表达卵胶蛋白的强度可达0.8 MPa明显高于没有糖基化修饰的原核表达重组卵胶蛋白强度（0.2 MPa）,因此糖基化修饰能够使粘结性能有大幅提升。另外我们猜测漆酶、转谷酰胺酶等交联酶能催化卵胶蛋白直接形成共价的异肽键,与卵胶蛋白的粘性有关。由于转谷酰胺酶催化谷氨酰胺和赖氨酸之间形成异肽键,这也与卵胶蛋白氨基酸序列中存在大量的Q和K吻合,因此我们猜测粘液腺中存在转谷酰胺酶,能够帮助卵胶蛋白进行交联。我们通过粘液腺转录组数据找到3种标注为转谷酰胺酶的基因,并将其与豚鼠转谷酰胺酶序列进行比对,确定粘液腺中确实存在转谷酰胺酶。将天然卵胶蛋白、真核表达重组卵胶蛋白及原核表达重组卵胶蛋白进行体外交联,SDS-PAGE证明其确实能催化卵胶蛋白的交联。对交联前后的重组蛋白和天然蛋白进行粘结强度的检测,发现交联后的真核重组蛋白粘结强度可达2.2 MPa能够更好的接近天然卵胶蛋白的粘结强度2.6 MPa,说明家蚕分泌卵胶蛋白对卵腹面进行固定时,转谷酰胺酶发挥着重要的促进卵胶蛋白交联固化的效果,能提高卵胶蛋白的粘性。