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目的:腺病毒(Adenovirus,Adv)是一种能够感染正常人群、致病性很强的病毒,引起包括呼吸道疾病、结膜炎、胃肠炎、出血性膀胱炎等不同器官的多种疾病,尤其对感染腺病毒的儿童,病死率可高达50%以上。现代的病毒诊断技术检测速度较慢,无法满足快速诊断的需要。本文利用DNA生物传感器技术,构建两种能够快速检测腺病毒的DNA生物传感器的诊断模型。
方法:本课题构建了两种新型的DNA生物传感器诊断腺病毒的诊断模型。根据序列比对查找出腺病毒保守特异探针序列,人工合成单链DNA(ssDNA)制成生物探针。一、将2,3-二巯基丁二酸(DMSA)通过自组装于金电极表面,被标记了氨基的NH2-ssDNA探针在1-乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亚氨基盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)交联剂的作用下,通过共价结合到金电极表面自组装的DMSA的羧基端。该探针能够与溶液中互补序列进行杂交,同时,菲哕啉钴作为电化学杂交指示剂插入在金表面形成的杂交双链结构中,用差分脉冲伏安法或循环伏安法能够有效的测定还原峰电流,根据峰电流的变化能够鉴定出待测溶液中是否含有腺病毒特异序列。二、纳米铂沉积于玻碳电极表面,单链DNA探针自然吸附于纳米铂/玻碳电极表面,用亚甲基蓝作为电化学杂交指示剂,用循环伏安法测定溶液中互补序列DNA含量,根据峰电流变化鉴定溶液中序列是否是腺病毒特异性序列;
结果:一、2,3-二巯基丁二酸(DMSA)自组装金电极DNA生物传感器诊断模型的构建:(1)金电极抛光处理与清洁净化的表征;(2)DMSA在金电极表面的自组装修饰(DMSA/Au);(3)NH2-ssDNA探针通过羧胺键在DMSA/Au表面固定,制备了DNA生物传感器诊断模型;(4)利用差分脉冲伏安法或循环伏安法能够鉴定溶液中互补DNA序列,该电化学生物传感器的测定范围是1.03×10-9 mol/L到2.06×10-7 mol/L.检测限为5.23×10-10 mol/L。二、铂纳米修饰玻碳电极DNA生物传感器诊断模型的构建:(1)玻碳电极抛光处理与清洁净化的表征;(2)铂纳米在玻碳电极表面的沉积修饰(Pt-nano/GCE);(3)ssDNA固定于Pt-nano/GCE表面,制成DNA生物传感器模型;(4)该DNA生物传感器循环伏安法的测定范围是2.12×10-9至1.69×10-7mol/L,其线性回归方程为C=25.78-2.35 ip,检出限为7.01×10-10mol/L。
结论:本课题将纳米技术、DNA生物传感器技术和腺病毒分子生物学诊断技术有机结合起来,构建了两种用于检测腺病毒特异性DNA序列的电化学生物传感器的诊断模型。其一,利用DMSA自组装金电极,通过偶联剂固定ssDNA探针,构建ssDNA/DMSA/Au传感器的诊断模型。其二,利用纳米铂修饰玻碳电极,自然吸附ssDNA腺病毒生物探针,构建了ssDNA/Pt-nano/GCE传感器的诊断模型;本研究对于开发人腺病毒快速诊断仪器和诊断试剂盒以及其他类病毒诊断技术开发都具有重要的实用价值。