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目的: 选用巴斯德研究所(Institute Pasteur)鲍氏不动杆菌多位点序列分型(multi-locus sequence typing，MLST)方案，对临床来源的多种药物耐药鲍氏不动杆菌分离株进行MLST分型，并应用多种软件分析鲍氏不动杆菌的种群结构和群体遗传学特征;PCR扩增多重耐药鲍氏不动杆菌临床分离株6种OXA型碳青霉烯酶基因（blaOXA-23-like，blaOXA-24-like，blaOXA-58-like，blaOXA-51-like，blaOXA-69-like和blaOXA-143-like）以及插入序列blaISAba1的携带情况，以了解鲍氏不动杆菌中碳青霉烯类抗生素产生抵抗力可能的分子基础和遗传学机制;分析临床来源的耐环丙沙星鲍氏不动杆菌中，9个质粒来源的喹诺酮药物耐药相关基因(qnrA，qnrB，qnrC，qnrD，qnrS，qepA，aac(6)-Ib-cr，oqxA和oqxB基因）携带情况，以及染色体喹诺酮耐药决定区基因(gyrA，gyrB，parC和parE基因)发生耐药性突变情况，并推测临床来源的鲍氏不动杆菌对喹诺酮类抗生素可能的遗传学机制。 方法: 1.临床来源的多重耐药鲍氏不动杆菌MLST分型: 收集国内几家医院分离的多重耐药鲍氏不动杆菌，依照巴斯德研究所鲍氏不动杆菌MLST分型方案，分别针对7个看家基因进行PCR扩增及测序。7个看家基因测序结果与MLST数据库中收录的相应等位基因序列比对后，得到了各菌株的等位基因谱和ST型。应用Bionumeric6.6、eBURST v3.0、MEGA5.1、SplitTree4.0、START2.0和RDP v3.44等软件进行分析，以获得鲍氏不动杆菌种群结构和群体遗传学特征。 2.临床来源鲍氏不动杆菌中OXA型碳青霉烯酶基因检测: 应用多重PCR技术同时扩增鲍氏不动杆菌中五种OXA型碳青霉烯酶基因（blaOXA-51-like，blaOXA-23-like，blaOXA-24-like， blaOXA-58-like和blaOXA-143-like基因）。另外，单独扩增blaOXA-69-like， blaISba1F-OXA51R，blaISba1F-OXA23R以及blaISAba1基因，并对blaOXA-69-like基因阳性扩增产物进行双向测序，并与NCBI中已知基因序列进行比对。 3.耐环丙沙星鲍氏不动杆菌中喹诺酮耐药相关基因检测: 应用PCR技术分别扩增耐环丙沙星鲍氏不动杆菌中9个质粒携带的喹诺酮类耐药基因(qnrA，qnrB，qnrC，qnrD，qnrS，qepA，aac(6)-Ib-cr，oqxA和oqxB基因），各基因PCR扩增并测序后与NCBI数据库中已知基因比对;对临床来源鲍氏不动杆菌环丙沙星耐药株染色体喹诺酮耐药决定域基因，包括gyrA，gyrB，parC和parE进行PCR扩增，阳性扩增产物测序后与参考菌株ATCC17978相应基因序列进行比对，以了解鲍氏不动杆菌喹诺酮耐药决定区耐药性突变情况。 结果: 1.鲍氏不动杆菌多重耐药株MLST分型: 共计247株多重耐药鲍氏不动杆菌的7个看家基因进行了成功的PCR扩增以及测序。7个看家基因，包括cpn60，fusA，gltA，pyrG，recA，rplB和rpoB获得的等位基因数目分别为13，10，10，8，10，8和12个，其中包括提交核酸序列至巴斯德网站后获得的14个新等位基因，包括:cpn60(46)，cpn60(47)，cpn60(48)，cpn60(49); fusA(46)，fusA(47); gltA(49),gltA(50); recA(49); rpoB(42),rpoB(43),rpoB(48),rpoB(49),rpo B(50)。所有菌株分属于23个ST型，包括:ST2，ST63，ST68，ST104，ST113，ST185，ST187, ST193, ST207, ST214, ST215, ST216, ST217, ST218, ST219, ST220, ST221,ST222，ST223，ST224，ST225，ST226和ST227。有83.8％(207/247)菌株属于ST2型，且ST2型菌株在6个菌株来源城市（或医院）都有分布。应用Bionumeric6.6构建了最小生成树;应用MEGA5.1构建了本研究中所有菌株的系统发育进化树;eBURST v3.0分析显示本研究中的菌株主要分布于10个克隆群，其中有86.6％的菌株分布于克隆群2（包括214株菌，5种ST型），此外还包括6个Singletons;应用SplitTree4.0构建了网状进化树;START2.0计算出ISA=0.8373，显示连锁不平衡;RDP v3.44估计到了4个可信的重组事件。 2.临床来源鲍氏不动杆菌OXA型碳青霉烯酶基因检测: 多重PCR结果显示，所有菌株blaOXA-51-like基因携带率达94.7％(n=234)，是携带率最高的OXA型碳青霉烯酶耐药基因;blaOXA-23-like基因携带率为74.1％(n=183); blaOXA-58-like基因携带率为0.8％(n=2);所有菌株均未检测到携带blaOXA-24-like或blaOXA-143-like基因。此外，blaISbaIF-OXA51R阳性率为10.5％(n=26); blaISba1F-OXA23R阳性率为10.5％(n=26);插入序列blaISAba1阳性率高达96.4％(n=238)。blaOXA-69-likePCR扩增阳性率达83.4％(n=206)，其扩增产物经双向测序后与NCBI数据库中已知序列比对显示具有高度同源性。 基于所有OXA型碳青霉烯酶基因检测结果的组合，进行耐药基因分型，共获得了25种耐药基因型。其中基因型1（blaOXA-51-like+blaOXA-23-like+blaISba1F-OXA23R+blaOXA-69-like+blaISAba1）菌株数量最多(n=146，59.1％)。其它基因型菌株数量较少。 3.耐环丙沙星鲍氏不动杆菌中喹诺酮类耐药相关基因检测: 所有菌株均未检出携带任何质粒来源的喹诺酮类耐药基因，但aac(6)-Ib基因携带率为83.3％(95/114)，提示这些菌株可能同时具有氨基糖苷类抗生素耐药性。染色体喹诺酮耐药决定区基因，包括gyrA，gyrB，parC和parE基因的测序结果与敏感株相应基因序列进行比对后发现，绝大部分菌株(113/114，99.1％)的gyrA基因发生了Ser83Leu突变，其中67株菌(67/114，58.8％)还同时发生了parC基因的Ser80Leu突变，以上两种突变是常见的喹诺酮耐药相关突变。与标准菌株进行比对，受试菌株gyrB基因Arg393Ser、Arg393Cys、Thr401Ala、Pro406Ser、Va1430Phe、Cys440Ser和Gly480Arg突变率分别为95.6％，0.9％，96.5％，96.5％，100％，96.5％，96.5％; parE基因在七个位点发生了同义突变，突变率为96％以上。 将所有菌株gyrA、gyrB、parC和aac(6)-Ib的结果汇总进行菌株分型，共得到了8种基因型。其中，基因型1菌株数目最多，包括62株菌，其特点是具有已知与环丙沙星耐药相关的GyrA-Ser83Leu和ParC-Ser80Leu双突变，gyrB中包括7种非同义突变，以及aac(6)-Ib扩增阳性;其次为基因型5（32株菌），其与基因型1的区别是没有ParC-Ser80Leu氨基酸改变，以上两种基因型占所有菌株的绝大多数(94/114，82.5％)。 结论: ST2型菌株是国内乃至世界范围内鲍氏不动杆菌流行的主要菌株，其菌株数量最多且流行范围广泛。本研究中估计到了4个种群内的重组事件，计算出标准化关联指数ISA=0.8373，证实种群中存在连锁不平衡，且86.6％(214株)的菌株分布于高度适应性克隆群2，进一步证实了鲍氏不动杆菌的epidemic种群结构特征。 临床鲍氏不动杆菌多重耐药株对碳青霉烯类抗生素产生抵抗性的原因，可能与OXA23和OXA51型碳青霉烯酶的产生以及blaISAba1的存在关系更为密切。而临床鲍氏不动杆菌多药耐药株是否存在其它碳青霉烯类耐药机制，仍需进行更加细致深入的研究。 临床鲍氏不动杆菌对喹诺酮类抗生素耐药的原因，主要是染色体喹诺酮耐药决定区发生了GyrA-Ser83Leu和ParC-Ser80Leu突变。此外，质粒介导的喹诺酮类耐药作为近几年新发现的机制，应给予持续关注。