一、背景与目的肺癌的发病率和死亡率高居各种恶性肿瘤的首位,严重危害人类健康,是全球范围内的公共卫生问题。肺腺癌是肺癌的主要病理类型。化学治疗是目前临床治疗肺腺癌一线方案的主要组成部分。但是,化疗耐药是肺腺癌临床治疗所面临的重大难题,化疗耐药的形成与肿瘤耐药相关基因的遗传学及表观遗传学修饰的分子调控密切相关。组蛋白乙酰化是表观遗传修饰调控基因表达的重要方式之一,调控基因表达参与多种生理及病理过程。本课题前期研究发现:微小RNA(micro RNA,miR)-200b在肺腺癌耐药细胞中呈现显著的低表达,升高miR-200b表达水平能显著逆转肺腺癌的化疗耐药表型;进一步研究发现抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetyltransferase,HDAC)后,miR-200b表达水平明显上调。本课题拟在前期成功建立人肺腺癌细胞多西他赛耐药模型、miR-200b功能学以及生物信息学分析基础上,通过免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀、位点突变、荧光素酶活性试验等实验方法探索HDACs负向调控miR-200b表达的分子机制,从体外和体内等层面探讨miR-200b表达的组蛋白乙酰化调控与肺腺癌化疗耐药之间的关系,从而为肺腺癌的个体化治疗和逆转肺腺癌化疗耐药提供新的策略。二、材料与方法1.运用实时定量RT-PCR法检测人肺腺癌细胞株SPC-A1和H1299及其对应多西他赛耐药株SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞miR-200b的表达水平,以及给予DNA甲基转移酶特异性抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理后miR-200b的表达水平变化;焦磷酸测序法检测给予5-Aza-CdR后,两种耐药株miR-200b启动子区甲基化水平变化。2.Western blot法检测HDAC抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)和丙戊酸(valproic acid,VPA)处理后,两种耐药株乙酰化组蛋白H3的蛋白水平变化;实时定量RT-PCR法检测给予HDAC抑制剂TSA和VPA处理后耐药株miR-200b的表达水平变化。3.MTT法测定给予不同浓度HDAC抑制剂TSA和VPA处理后,耐药株SPC-A1/DTX和H1299/DTX对DTX和PTX的半数抑制浓度(IC50)值。4.合成针对HDAC1-11 的siRNAs,分别转染SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞,Western blot法验证各种siRNAs的转染效果,实时定量RT-PCR法检测转染后miR-200b的表达水平;实时定量RT-PCR法和Western blot法分别检测人肺腺癌亲本株 SPC-A1 和 H1299 和对应耐药株 SPC-A1/DTX 和 H1299/DTX 中 HDAC1/4 的mRN A和蛋白表达水平。5.分析miR-200b的启动子区,构建含Sp1结合位点的虫荧光素酶报告基因载体[pGL3-promoter-1,pGL3-promoter-2,pGL3-promoter-1(Sp1-1mut),pGL3-promoter-1(Sp1-2mut),pGL3-promoter-1(Sp1-1/2mut),pGL3-promoter-2,pGL3-promoter-2(Sp1mut)],分别构建针对HDAC 1/4基因的干扰质粒(sh-HDAC 1/4)。将上述虫荧光素酶报告基因载体转染或与sh-HDAC 1/4共转染SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞,双荧光素酶法检测虫荧光素酶活性。sh-HDAC1/4分别或与siRNA-Sp1共转染SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞,实时定量RT-PCR法检测miR-200b的表达水平。6.免疫共沉淀法验证HDAC1以及HDAC4与Sp1在活细胞内的结合,染色质免疫共沉淀法验证Sp1与miR-200b基因启动子结合,染色质免疫共沉淀法验证HD AC1/4与miR-200b基因启动子结合,染色质免疫共沉淀检测sh-HDAC 1/4转染后miR-200b基因启动子区Sp1结合区域组蛋白H3乙酰化水平的变化。7.收集68例使用过含多西紫杉醇化疗方案的晚期肺腺癌患者的肿瘤组织标本,根据治疗反应的不同,分为“敏感组”和“不敏感组”;实时定量RT-PCR法检测上述两组HDAC1/4、miR-200b的mRNA水平;并将HDAC1/4与miR-200b 的mRNA表达水平进行相关性分析;分析HDAC1/4的表达水平与临床预后的关系。8.合成针对miR-200b基因的单链抑制物(miR-200b inhibitor)以及miR-200b的模拟剂(mimics),从其他研究者手中获得针对HDAC1/4基因的过表达质粒(pcDNA3.1/HD AC 1/4);将上述质粒或小RNA分别或与sh-HDAC 1/4共转染SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞,MTT法测定经上述处理的耐药细胞对DTX和PIX 的 IC50 值。9.将miR-200b inhibitor,sh-HDAC1/4及对照载体分别或共转染SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞,克隆形成实验测定细胞体外增殖能力,流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡率,Westernblot法测定cleaved-Caspase 3和Caspase 3的蛋白水平变化。10.构建pri-miR-200b基因表达载体(pPG/miR-200b),将pPG/miR-200b,sh-HDAC 1/4及对照质粒稳定转染到H1299/DTX细胞,建立裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤后给予DTX腹腔注射,绘制肿瘤生长曲线,6周时处死裸鼠后获取瘤体组织,实时定量RT-PCR检测miR-200b的表达水平,免疫组化染色检测肿瘤组织Ki67和PCNA的表达水平,Tunel染色法测定各组的凋亡水平差异。11.将miR-200b inhibitor,sh-HDAC1/4及对照载体分别或共转染SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞,实时定量RT-PCR检测E2F3、Aurora-A和Survivin的mRNA表达水平,Westernblot检测E2F3、Aurora-A和Survivin的蛋白表达水平;Westernblot检测裸鼠肿瘤组织中HDAC1/4、E2F3、Aurora-A和Survivin的蛋白表达水平,免疫组化染色检测裸鼠肿瘤组织中HDAC1/4、E2F3、Aurora-A和Survivin的表达水平。12.分别分析Aurora-A和Survivin的启动子区,构建含E2F3结合位点的虫荧光素酶报告基因载体[pGL3-Aurora-A,pGL3-Aurora-A(E2F3-1 mut),pGL3-Aurora-A(E2F3-2 mut),pGL3-Aurora-A(E2F3-1+2 mut),pGL3-Survivin,pGL3-Survivin(E2F3 mut)],转染或与 sh-HDAC 1/4、miR-200b inhibitor共转染SPC-A1/DTX细胞,双荧光素酶法检测虫荧光素酶活性。转染sh-contro1、sh-HDAC1/4到SPC-A1/DTX细胞,染色质免疫共沉淀检测sh-HDAC 1/4X对Aurora-A和Survivin启动子上E2F3结合量的影响。三、结果1.与亲本株SPC-A1和H1299相比,耐药株SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中的miR-200b的表达水平明显降低(p<0.01);给予足够浓度的5-Aza-CdR后,SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中的miR-200b的表达水平未见明显变化(p>0.05);焦磷酸测序发现SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞miR-200b启动子区呈现高甲基化状态;给予20μmol/L的5-Aza-CdR后,其甲基化水平变化未见显著改变。2.给予TSA和VPA处理后,两种耐药株乙酰化组蛋白H3的蛋白表达水平明显升高。给予TSA和VPA后,SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞中的miR-200b的表达水平明显升高(p<0.01),并呈浓度和时间依赖性。3.HDAC抑制剂TSA和VPA可降低耐药株SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞对DTX和PTX的IC50值(p<0.01),并呈浓度依赖性。4.针对HDAC1-11的siRNAs都可以降低相应HDAC的蛋白表达水平;干扰HDAC1/4后,两种耐药株miR-200b的mRNA表达水平都明显上升(p<0.01)。耐药株SPC-A1/DTX和H1299/DTX细胞HD AC 1/4的mRN A和蛋白表达量明显高于相应亲本株SPC-A1和H1299细胞。5.经过分析发现,miR-200b的两个启动子区都含有Sp1结合位点;miR-200b的两个启动子在两种耐药株中都有荧光素酶活性(p<0.01);干扰HDAC1/4后,miR-200b的两个启动子荧光素酶活性明显升高(p<0.01);当对启动子区Sp1结合位点进行部分或完全突变后,再给予干扰HDAC1/4后,miR-200b的两个启动子活性升高程度降低或无明显变化(p<0.05或p>0.05)。干扰HDAC1/4后,耐药株miR-200b的mRNA表达水平明显升高(p<0.01);干扰Sp1可部分逆转干扰HDAC1/4所引起的miR-200b表达水平升高(p<0.05)。6.在活细胞状态下,Sp1既可以与HDAC1结合也可以与HDAC4结合;Sp1、HDAC1/4可以与miR-200b基因启动子区的相应Sp1结合位点结合;下调HDAC1/4表达可以提高miR-200b基因启动子区Sp1结合区域组蛋白H3乙酰化水平。7.在多西紫杉醇化疗方案不敏感的肺腺癌肿瘤标本中,HDAC1/4的mRNA水平较敏感组明显升高(p<0.01)。在临床组织标本中,miR-200b的表达水平既与HDAC1 呈负相关(rho=-0.799,p<0.01)也与HDAC4呈负相关(rho=-0.781,p<0.01)。与低水平HDAC1组相比,高水平HDAC1组的无进展生存期明显缩短(p<0.05)。同样,与低水平HDAC4组相比,高水平HDAC4组的无进展生存期明显缩短(p<0.01)。8.抑制HDAC1/4后,耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX对DTX和PTX的IC50值显著下降(p<0.01);抑制miR-200b可部分逆转干扰HDAC1/4的上述效应(p<0.05)。过表达HDAC1/4后,耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX对DTX和PTX的IC50值显著上升(p<0.05);上调miR-200b后,过表达HDAC1/4对耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX对DTX和PTX的IC50值无明显影响(p>0.05)。9.在DTX存在的情况下,抑制HDAC1/4后,耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX的体外增殖能力显著下降(p<0.01);抑制miR-200b可部分抵消干扰HDAC1/4引起的耐药细胞体外增殖能力的降低(p<0.05)。在DTX存在的情况下,抑制HDAC4后,耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX的细胞周期S期减少,G2/M期增加(p<0.01);抑制miR-200b可部分抵消干扰HDAC4引起的耐药细胞细胞周期S期减少,G2/M期增加(p<0.05)。在DTX存在的情况下,抑制HDAC1/4后,耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX的早期凋亡率显著增加(p<0.01);抑制miR-200b可部分减弱干扰HDAC1/4引起的耐药细胞早期凋亡率的增加(p<0.05)。抑制HDAC1/4后,耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX中cleaved-Caspase 3的蛋白表达水平显著增加;抑制miR-200b可部分减弱干扰HDAC1/4对耐药细胞cleaved-Caspase 3的蛋白表达的影响。10.与对照组相比,给予DTX后,抑制HDAC1/4组或过表达miR-200b组的裸鼠皮下移植瘤生长明显减慢(p<0.05)。与对照组相比,HDAC1/4抑制组或miR-200b过表达组的miR-200b的mRNA水平明显升高(p<0.01)。在移植瘤组织中,抑制HDAC1后,Ki67和PCNA的阳性率明显下降,凋亡细胞的阳性率明显增加;抑制HDAC4或过表达miR-200b后,Ki67和PCNA的阳性率明显下降,凋亡细胞的阳性率明显增加。11.在耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX中,抑制HDAC1 后,E2F3和Survivin的mRNA及蛋白表达水平均明显下调(p<0.01);抑制HDAC4后,E2F3、Survivin和Aurora-A的的mRNA及蛋白表达水平均明显下调(p<0.01);抑制miR-200b可部分抵消抑制HDAC1/4对E2F3、Survivin或Aurora-A表达水平的影响(p<0.05)。在移植瘤组织中,抑制HDAC1后,E2F3和Survivin的蛋白表达水平明显下调,E2F3和Survivin的阳性率明显下降;抑制HDAC4或过表达miR-200b后,E2F3、Survivin和Aurora-A的蛋白表达水平明显下调,E2F3、Survivin和Aurora-A的阳性率明显下降。12.Aurora-A和Survivin的启动子区有E2F3转录因子的结合位点;在耐药株SPC-A1/DTX细胞中,Aurora-A和Survivin的启动子有荧光素酶活性(p<0.01);干扰HDAC1后,Survivin的启动子活性明显降低(p<0.01);当对S urvivin启动子区E2F3结合位点进行突变后,干扰HD AC 1对S urvivin的启动子活性无明显影响(p>0.05)。干扰HDAC4后,Aurora-A和Survivin的启动子活性明显降低(p<0.01);当对Aurora-A和S urvivin启动子区E2F3结合位点进行突变后,干扰HDAC4对Aurora-A和Survivin的启动子活性无明显影响(p>0.05),对Aurora-A启动子区E2F3部分结合位点进行突变可减弱干扰HDAC4对Aurora-A启动子活性的影响(p<0.05)。在SPC-A1/DTX细胞中,干扰HDAC1后,Survivin启动子上的E2F3转录因子结合量明显降低(p<0.01),而Aurora-A启动子上的E2F3转录因子结合量未见明显改变(p>0.05);干扰HDAC4后,Aurora-A和Survivin启动子上的E2F3转录因子结合量明显降低(p<0.01)。四、结论与意义1.组蛋白乙酰化而非DNA甲基化参与了人肺腺癌耐药细胞SPC-A1/DTX和H1299/DTX miR-200b的表达调控,进而参与调控了人肺腺癌的化疗抵抗。2.在HDAC1-11的亚型中,HDAC1/4参与调控耐药株miR-200b的表达,HDAC1/4和miR-200b表达水平与肺腺癌患者预后密切相关。3.HDAC1/4/miR-200b信号通路可以在体内、体外层面参与调控人肺腺癌的化疗耐药。4.HDAC1/4/Sp1/miR-200b 信号轴通过进一步调控 E2F3/Aurora-A 和E2F3/S urvivin的表达可能是HDAC 1/4/miR-200b信号通路参与调控人肺腺癌化疗耐药的重要分子机制。5.本研究首次报道了 HDAC1/4/Sp1/miR-200b/E2F3/Aurora-A/S urvivin 信号轴参与调控人肺腺癌化疗耐药;揭示了在临床标本中HDAC 1/4与miR-200b表达水平密切相关,并且与肺腺癌患者预后密切相关;本课题从组蛋白乙酰化层面揭示了人肺腺癌细胞中miR-200b基因表达下调的原因,为临床肺腺癌的个体化治疗及逆转人肺腺癌的化疗抵抗提供了新的分子靶点。