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弧菌(Vibrio)种类繁多,广泛分布于自然界中,特别是在水生动物及水体中比较常见。其中霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌是较常见的致病性弧菌,不仅对动物有致病性,还严重威胁着人类健康。针对这5种弧菌,建立敏感快速的检测方法非常必要。副溶血弧菌是引起食源性细菌胃肠炎的最主要原因,主要的毒力因子是耐热直接溶血素(TDH)和耐热相关溶血素(TRH)。根据副溶血弧菌的两种毒力因子tdh、trh和种特异性基因toxR,分别设计1对特异性的引物及相应的TaqMan探针,应用于荧光定量PCR反应。通过优化反应体系和反应参数,建立单重和三重荧光定量PCR,用于快速准确检测副溶血弧菌。研究表明,建立的方法扩增效率均在95%-110%之间;特异性试验表明,只有副溶血弧菌扩增明显,对其它细菌无扩增,表明该方法良好的特异性;单重反应灵敏度比常规PCR高出100倍,多重反应布菌检测灵敏度均在103CFU/g左右,表明该法敏感性强;重复3次试验,每组变异系数均小于1.8%,表明该方法重复性好。以霍乱弧菌的种特异性基因外膜蛋白W基因(ompW)和毒力因子霍乱毒素基因(ctx)、溶血素(hly)为靶基因,分别设计1对特异性的引物及相应的TaqMan探针,通过优化各个反应成分的浓度和反应参数,建立了三重荧光定量PCR。单重荧光定量PCR实验发现其灵敏度比常规PCR高出了 1000倍,而在多重反应布菌检测灵敏度均小于30CFU/g;与其他细菌无扩增,表明特异性良好;重复3次试验后的每组变异系数均小于1.1%,表明该法重复性好。以创伤弧菌的毒力基因溶血素基因(vvhA)、拟态弧菌的毒力基因溶血素(vmhA)和溶藻弧菌的毒力基因胶原蛋白酶基因(vacol)为靶标,分别设计了 1对特异性的引物及相应的TaqMan水解探针,经过条件优化,在单重实时荧光定量PCR显示良好结果的基础上建立了三重实时荧光定量PCR。该方法扩增效率均在95%-110%之间;特异性试验表明,只有创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌基因组扩增明显,表明该方法良好的特异性;单重反应灵敏度比常规PCR高出100倍,多重反应布菌检测灵敏度均在3×103-3×104CFU/g,表明该方法敏感性强;重复3次试验,每组变异系数均小于3%,表明该方法重复性好。总之,本研究针对霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌等,建立了实时荧光定量PCR检测方法,为5种致病弧菌感染的流行病学调查与病原监测提供了工具。